RNAi 技术原理PPT课件

.,1,RNAi的实验方法,细胞生物学樊国达2014.11.14,.,2,目录,miRNA的原理及机制RNAi的机制及与miRNA的关系RNAi实验的三大基本路线RNAi机制的缺陷,.,3,miRNA的原理,MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约2025个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体（RISC），通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。,.,4,miRNA如何行使功能？,与mRNA的3端非编码区特定位点(其第28个核苷酸)绑定：与mRNA完全互补时会引发mRNA降解；不完全的与mRNA配对时，会引发转录后的基因沉默（抑制靶基因的表达）从而抑制或阻止相应的mRNA翻译过程。,.,5,miRNA途径：miRNA可以降解mRNA，或者抑制mRNA翻译蛋白质,RNAi借用了天然的miRNA作用途径,.,6,RNAi作用机制,.,7,RNAi实验三大基本路线,.,8,线路一：非哺乳动物细胞体系的RNAi实验和选择,比如果蝇，线虫，拟南芥等低等生物和植物，由于不涉及抗病毒免疫应答反应，通过体外转录即可制备目标基因的dsRNA（200bp左右），直接用长双链RNA进行RNAi实验。,.,9,（1）构建目的基因载体，选取目的基因的特异性序列（约200bp300bp），构建到T载体上。（2）使用5端连接有T7启动子的引物PCR扩增目的基因，得到两端均连接有T7启动子序列的目的基因片段。（3）T7RNA聚合酶进行转录。dsRNA、ssRNA、DNA模板。（4）加入Rnase和Dnase消除ssRNA和DNA模板。（5）离心纯化dsRNA。,.,10,.,11,siRNA导入细胞的方法,对于线虫而言，,.,12,线路二：哺乳动物细胞RNAi实验：siRNA的设计，合成,哺乳动物细胞导入30bp以上的长双链RNA（dsRNA），往往会诱发非预期的抗病毒应答反应，所以不能用体外合成的dsRNA直接导入细胞，常见的做法之一是直接制备1927bp左右的siRNA，然后再将siRNA转入哺乳动物细胞。,.,13,siRNA的转染,哺乳动物转染的常见方法有：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、机械法（例如,显微注射和基因枪）、阳离子脂质体试剂，其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。,.,14,siRNA的转染,有些研究人员发现，携带siRNA的脂蛋白纳米颗粒通过内吞作用进入细胞，一旦纳米颗粒进入细胞，就会被捕获在小泡中，这阻碍了大部分siRNA接近位于细胞质的目标mRNA。甚至会在一小时内将其分解并排出细胞。,.,15,siRNA的转染,研究显示，在纳米颗粒的再利用过程中，蛋白NPC1是一个主要因子。没有这一蛋白，纳米颗粒就不会被细胞排出，让siRNA有更多的时间去结合目标mRNA。NPC1缺乏时会出现交通拥堵，这样siRNA就有更多的时间逃逸出来，但也会影响细胞的其他生理活动，所以现在大部分研究人员都在通过改进脂蛋白纳米颗粒的结构，来增强siRNA的转染效率。,.,16,线路三：shRNA表达载体和病毒载体,这类载体都包含有一个RNA聚合酶启动子和一个45个连续的T构成的转录终止位点以及选择标记，选用Pol启动子是因为此启动子总是在距其一定距离的位置起始转录，而遇到45个连续的T就终止转录，并且终止于转录终止位点第二个碱基处，十分精确。,.,17,此法需首先化学合成一段编码siRNA正义和反义链的模板，正义与反义序列之间由一段环(1oop)序列隔开。插入载体Pol启动子下游，然后转入细胞，环序列可使转录出的RNA链折叠成具发夹结构的小RNA分子（shRNA），这些小RNA可被细胞内的Dicer切割为长21bp的siRNA。,.,18,.,19,RNAi作为一种重要的基因转录后沉默机制，广泛应用于基因功能研究，肿瘤及病毒感染性疾病治疗的实验研究，其核心内容是siRNA能够抑制同源基因的表达。对于siRNA而言，现在颇有争议的地方在于它对靶基因的沉默特异性，主要体现在两个方面：（1）脱靶效应。（2）打破内源性miRNA的平衡。,RNAi机制的缺陷,.,20,脱靶效应,即siRNA对靶基因的沉默并不一定严格按照序列特异性方式进行。（1）对于21-23nt的siRNA，只需少至7nt的序列与mRNA同源，均可导致该基因的沉默。（2）诱导机体或细胞产生天然或获得性免疫应答，被一些蛋白酶降解，从而降低siRNA对靶基因的特异性。,.,21,降低siRNA脱靶效应,（1）要减少脱靶效应，可以将针对同一mRNA的不同siRNA混合起来使用。这些siRNA作用于同一个目标，每种siRNA的浓度得以降低，稀释了各自的脱靶效应，但不损害靶的特异性敲除。,.,22,（2）对siRNA的化学修饰,siRNA的化学修饰主要有三类：磷酸骨架修饰（如硫代修