细胞生物学研究方法 1

第3章细胞生物学研究方法,第一节细胞形态结构的观察方法,大多数动植物细胞20-30um,肉眼的分辨率一般只有0.2mm，很难识别单个细胞，须借助显微镜,一、光学显微镜(lightmicroscope),从细胞的发现、细胞学说的建立，直至今天光学显微镜仍然是细胞生物学研究的重要工具为细胞,（一）普通复式光学显微镜,由3部分组成：光学放大系统(目镜与物镜)、照明系统(光源和聚光镜)、镜架及调节系统,显微镜最重要的性能参数是分辨率，不是放大倍数分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离,普通光学显微镜最大分辨率0.2um,普通光镜观察的生物组织样品需要固定、包埋、切片、染色等,Figure9-10,11aMolecularBiologyoftheCell(GarlandScience2008),（二）相差显微镜phase-contrastmicroscope,利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察,相差显微镜是在普通光学显微镜的基础上，添加两个元件，即“环状光阑”和在物镜后焦面上的“相差板”，从而可将这种光程差或相位差，通过光的干涉作用，转换成振幅差,微分干涉显微镜以平面偏振光为光源，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别,Figure9-9MolecularBiologyoftheCell(GarlandScience2008),分辨率比普通光镜提高了一个数量级应用这一原理制备的录像增差显微镜可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程,微分干涉显微镜differential-interferencemicroscope,（三）荧光显微镜fluorescencemicroscope,荧光：分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波长比入射光长),荧光显微镜采用的光源、激发滤片、双分镜等与普通光学显微镜不同(或没有),荧光显微镜样品制备技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术样品可以是荧光染料标记，也可以用可产生荧光的绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合,（四）激光扫描共焦显微镜laserscanningconfocalmicroscope,在荧光显微镜上安装激光共焦成像系统，以激光为光源，提高了图像的分辨率聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像,通过调节焦平面可获得一系列不同切面上的细胞图像，重构样品三维结构,二、电子显微镜electronmicroscopeEM,(一)EM的基本知识,透射电子显微镜transmissionelectronmicroscopeTEM,透射电子显微镜利用波长比可见光短得多的、通过样品的电子束成像，放大倍数可达106,Figure9-42(part2of2)MolecularBiologyoftheCell(GarlandScience2008),由于细胞厚度及细胞各部分对电子的通透差异不大，透射电镜细胞样品需要超薄切片以及重金属盐染色,(二)主要电镜制样技术,1超薄切片技术ultrathinsection,应用超薄切片技术，几乎可以观察各种细胞的超微结构,2.负染色技术negativestaining,观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等重金属盐(磷酸钨或醋酸双氧铀)对铺展在铜网上的样品进行染色，而样品未被染色(故名负染),3.冷冻蚀刻技术freezeetching,又称冰冻断裂蚀刻复型技术，观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感，样品不需固定包埋。,4.电镜三维重构three-dimensionalrestrcture,电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的新技术。适应于分析膜蛋白、病毒、蛋白质-核酸复合体的三维结构。,低温电镜技术样品不经固定、染色和干燥，直接包被在冰膜中，在电镜内-160低温下利用相位衬度成像研究细胞和细胞器三维精细结构的电子扫描断层成像技术,低温电镜技术cryoelectronmicroscope,5.扫描电镜技术scanningelectronmicroscopeSEM,利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出的二次电子成像，可以得到样品表面的立体形貌,Figure9-49(MolecularBiologyoftheCell(GarlandScience2008),为了保证样品在扫描观察前不发生表面变形，通常需要利用CO2临界点干燥法对样品进行干燥处理样品在观察前还要喷镀一层金膜，以获得二次电子信号,一、超离心技术分离细胞组分,差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开。密度梯度离心：通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带,第二节细胞及其组分的分析方法,二、细胞成分的细胞化学显示方法,通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量。DNA的细胞分布Feulgen法，DNA呈紫红色。RNA的细胞分布Brachet法，RNA染成红色，DNA呈蓝绿色。碱性磷酸酶Gomori的钙钴法，碱性磷酸酶染成黑色。多糖PAS反应（过碘酸Schiff反应），多糖染成紫红色或品红色。不饱和脂肪酸四氧化锇，不饱和脂肪酸染成黑色。,福尔根反应,定性细胞中酶时，样品制备常采用冰冻切片，或以冷丙酮、甲醛进行短时间固定，以尽量保持酶活性,三、细胞内特异蛋白抗原的定位与定性,细胞内特异蛋白的显示可通过抗原抗体特异结合的方法得以实现若抗体偶联荧光染料，则可以通过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察为了观察特异蛋白在细胞内的精细定位，抗体需偶联电子致密物(胶体金)，用电镜观察。,（一）免疫荧光技术,它包括直接和间接免疫荧光技术两种步骤：荧光抗体制备、标本处理、免疫染色和观察。,（二）免疫电镜技术,在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。免疫胶体金技术受到越来越多的青睐,四、细胞内特异核酸的定位与定性,原位杂交（insituhybridization）：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置。,光镜水平的原位杂交技术(同位素标记或荧光素标记的探针)电镜水平的原位杂交技术(生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合),五、流式细胞术(flowcytometry),定量细胞中DNA、RNA或特异标记蛋白的含量，或细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量。,一、细胞培养（一）动物细胞培养,分为原代细胞和传代细胞细胞系和细胞株贴壁培养和悬浮培养,第三节细胞培养与细胞工程,（二）植物细胞培养,单倍体细胞培养：用花药或者通过愈伤组织诱导分化出芽和根，在人工培养基上进行培养最终长成植株。原生质体培养:体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁的原生质体经诱导分化长成植株。,Figure8-67aMolecularBiologyoftheCell(GarlandScience2008),二、细胞工程,（一）细胞融合与单克隆抗体技术介导细胞融合的物质同核体（homokaryon）、异核体（heterokaryon）、合核体（synkaryon）,单克隆抗体技术：通过HAT选择培养获得分泌单抗的杂交瘤细胞株,（二）显微操作技术与动物的克隆,显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射，如核移植、显微注射基因等,转基因(GFP)鸡、猪,C.BruceA.WhitelawFEBSLetters(2004)571:233236,一、荧光漂白恢复技术fluorescencephotobleachingrecoveryFPR,高能激光束的照射使某一区域荧光不可逆淬灭。由于生物膜的流动性，淬灭区荧光强度逐渐恢复，而定量测定生物的流动性,第四节细胞及生物大分子的动态变化,二、单分子技术与细胞生命活动的研究,指在单分子水平上对生物分子的行为(构象变化、相互作用、相互识别等）的实时动态检测以及在此基础上的操纵调控等,三、酵母双杂交技术yeasttwo-hybridsysytem,在体内分析蛋白质蛋白质相互作用利用转录激活因子的DNA结合域(DB)和转录激活域(AD)结合在一起才具有完整转录激活功能的原理。,四、荧光共振能量转移技术(fluorescenceresonanceenergytransferFRET),检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用如果两个蛋白相互作用，其中一个蛋白激发后发出的荧光可激发另一蛋白产生荧光,五、放射自显影技术,利用放射性同位素的电离射线对乳胶(含AgBr或AgCl)的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究2个主要步骤：即同位素标记的生物大分子前体的掺入和细胞内同位素的显示,对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪的标记方法：持续标记、脉冲标记,第五节模式生物与功能基因组的研究,研究细胞代谢与生长、分化、衰老、凋亡等，往往需要通过各种模式生物。,原核细胞，培养方便，生长快，基因结构简单，突变株的诱变，分离和鉴定容易，转基因技术成熟，进行基因定位简便易行。,细胞生物学常用的模式生物（一）大肠杆菌,（二）酵母,单细胞真核生物的代表：芽殖酵母和裂殖酵母，生长迅速并且易于遗传操作常用于白质相互作用、细胞周期、基因表达调控、膜泡运输、细胞分化和衰老等,（三）线虫(Caenorhabditiselegans),遗传背景清楚、生命周期只有3天，成体只有959个细胞，通体透明，便于胚胎发育中细胞分裂、分化以及细胞的死亡的研究,（四）果蝇(Drosophilamelanogaster),基因组序列已测定，与人类基因有很高的同源性，在遗传分析、染色体特性研究、胚胎发育的基因调控和细胞分化机制的研究、神经退行性疾病和学习、认知等领域的研究发挥重要的作用,（五）斑马鱼(Daniorerio),小型脊椎动物。它的许多基因与人类的基因存在对应的关系3个月性成熟、产卵多、胚胎体外发育，利于研究胚胎发育过程中细胞行为,（六）小鼠(Musmusculus),小型哺乳动物，遗传背景清楚，进化方面最接近人类，用于转基因小鼠、基因打靶、条件基因打靶、RNA干涉以及疾病模型,（七）拟南芥(Arabidopsisthaliana),十字花科的植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学、细胞生物学和分子生物学的研究,二、突变体制备技术,在R