第三章-细胞生物学研究方法-1-2

第三章细胞生物学研究方法,第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞组分的分析方法第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术,第一节细胞形态结构的观察方法,一、光学显微镜技术(lightmicroscopy)二、电子显微镜技术(Electromicroscopy)三、扫描遂道显微镜(Scanningtunnelingmicroscope,STM),(一)普通复式光学显微镜技术,一、光学显微镜技术,光学显微镜的组成部分：照明系统，包括光源和聚光器；光学放大系统，由物镜和目镜组成机械装置，用于固定材料和观察方便。,光镜样本制作:经过固定剂因定、包埋、5m薄切片、观察常用的固定剂：甲醛等常用的包埋剂：石蜡分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。最大分辩率：0.2m,（二）相差和微分干涉显微镜技术,相差显微镜（phasecontrastmicroscope）：1932年PZernike发明，1953年,诺贝尔物理奖。最大特点：可以观察未经染色的标本和活细胞。基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。,相差显微镜与普通光学显微镜不同之处：1.环形光阑(annulardiaphragm):位于光源与聚光器之间。作用:使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。2.相位板(annularphaseplate):在物镜中加涂有氟化镁的相位板，将直射光或衍射光的相位推迟1/4。A+相板：将直射光推迟1/4，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。B+相板：将衍射光推迟1/4，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。,微分干涉显微镜（differentialinterferencemicroscope）1952年，Nomarski发明，适于研究活细胞中较大的细胞器。优点:能显示结构的三维立体投影影像，立体感特别强，适合于显微操作(基因注入、核移植、转基因)。,原理:利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果能显示结构的三维立体投影。标本可厚一点，折射率差别更大，故影像立体感更强。录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒细胞器的运动。,(三)荧光显微镜技术(FluorescenceMicroscopy),原理与应用：利用较短波长的光使样品受到激火，产生较长波长的荧光，可作观察和分辩样品中产生荧光物质的成分和位置。包括：直接荧光标记技术;间接免疫荧光标记技术在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用,SingaporesNationalInstituteofEducation,UK,Singapore,SouthKorea,(四)激光共焦扫描显微镜技术（LaserScanningConfocalMicroscopy）,原理与应用：利用共焦光路和激光扫描技术获取生物样品不同层面的图像，再通过计算机组合成三维重构的影像。排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.41.7倍)，可重构样品的三维结构。,二、电子显微镜技术,（一）电子显微镜的基本知识（二）主要电镜制样技术（三）扫描电镜Scanningelectronmicroscope，SEMScanningprobemicroscope，SPM,（一）电子显微镜的基本知识,1.电镜与光镜的比较,2.电镜与光镜光路图比较,3.电子显微镜的基本结构,Figure:Earlyimagesofcells.(A)Drawingsofalivingplantcell(ahaircellfromaTradescantiaflower),observeddividingintotwodaughtercellsoveraperiodof2.5hoursbyEduardStrasburgerin1880.(B)Acomparablelivingcellphotographedrecentlythroughamodernlightmicroscope.(B,courtesyofPeterHepler.),（二）主要电镜制样技术,超薄切片技术(ultrathinsection)：用于电镜观察的样本制备。固定样品：锇酸和戊二醛包埋：环氧树脂，进样：以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度：4050nm，染色：采用重金属盐染色，以增大反差。,负染色技术（Negativestaining）：负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。,A,B,冰冻蚀刻技术（Freezeetching）冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。,快速冷冻深度蚀刻技术（quickfreezedeepetching）,特点：富有立体感不需包埋不需固定保持样品的真实结构,主要用于观察胞质中的细胞骨架纤维及其结合蛋白,4.电镜三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段,5.扫描电镜技术扫描电镜(Scanningelectronmicroscope，SEM),电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题,三、扫描遂道显微镜（ScanningtunnelingMicroscope,STM）,(80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器)包括：SPM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。分辩率：0.10.2nm;纵分辩率：0.001nm,细胞匀浆细胞核线粒体、溶酶体、微体、高尔基体沉淀含有过氧化酶体等囊泡核糖体、大分子复合物,*g=1.12rn210-5r:半径;n:每分种旋转数(rpm),第二节细胞组分的分析方法,一、离心技术用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物,差速离心(differentialcentrifugation):利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚组分和颗粒分开。密度梯度离心(densitycentrifugation):不同组分以不同有沉降速率沉降，形成不同的沉降带。沉降速率与物质的形态和大小有关，以沉降系数(S值)表示。CsCl法：CsCl可自行形成密度，所以不必特别制备密度梯度，只要将分离的样品与之混匀既可。在离心的过程中，具有不同密度的颗粒随CsCl密度梯度的形成重新分配；,蔗糖和甘油的最大密度为1.3g/cm3，所以只能用于分离在1.3g/cm3以下的细胞器或细胞结构；而CsCl的最大密度可达1.9g/cm3以上，可用于分离密度大于1.3g/cm3的DNA分子。*在原理上,由于具有不同密度的颗粒随CsCl密度梯度的形成重新分配，所以又称为浮力密度离心；而蔗糖和甘油则是在被离心的物质在下降的过程中由于密度的不同而被阻止在不同的部位,故是重力密度离心。,密度梯度离心densitycentrifugation,二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法（细胞化学法）,原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布与含量。DNA分布：Feulgen反应原理：切片先用稀盐酸处理使DNA，分子中脱氧核糖与嘌呤之间的连接键打开，形成醛基，再与Schiff试剂作用使细胞核DNA显紫红色。*Schiff试剂：无色亚硫酸品红复合物,多糖的存在：PAS（periodicacidSchiffreaction）,原理：过碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基变为乙二醛基，后者继而与Schiff试剂结合，形成紫红色反应产物。颜色反应的深浅取决于组织内多糖的乙二醇分子的多寡。,蛋白质的检测：Million反应,原理：氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的酪氨酸残基反应形成红色沉淀。脂类脂类物质包括脂肪和类脂：原理：标本用甲醛固定，冷冻切片，脂类保存较好。多用苏丹染料、油红O、尼罗蓝等溶于脂类的染料染色，使脂质呈色。也可用四氧化锇（OSO4）染色，脂肪酸或胆碱可使OSO4还原为OSO2而呈黑色。,三、特异蛋白抗原的定位与定性（免疫细胞化学）,免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique)：将免疫学方法与荧光标记技术相结合用来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。特点：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。蛋白电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹反应(Western-Blot)。,GetonemoretechniquemolecularbiologicalanalysisSouthernhybridization,免疫电镜技术：免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等,体外培养的BHK21细胞经选择性抽提后用抗Mr280103核骨架蛋白抗体进行免疫胶体金标记的结果,四、细胞内特异核酸的定位与定性,原位杂交技术：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列要染色体上或细胞中的位置的方法称为原位杂交。光镜水平的原位杂交技术（insituhybridization(同位素标记或荧光素标记的探针）电镜水平的原位杂交技术（insituhybridization）（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）,PLETHORAproteinsasdose-dependentmasterregulatorsofArabidopsisrootdevelopment,1、PCR技术对于已知全部或部分核苷酸序列的基因,可以通过聚合酶链反应(PCR),以基因组DNA或cDNA模板扩增得到目的基因片段。,2、实时定量PCR(RealtimequantitativePCR),实时荧光定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。与普通PCR的区别普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。,非特异性荧光标记：（1）SYBRGreen特异性荧光标记：（2）TaqMan（3）MolecularBeacon,1）DNA产物的荧光标记,（1）SYBRGreen法工作机理,SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光；变性时，DNA双链分开，无荧光在延伸结束阶段采集荧光信号。SYBRGreen也能和非特异的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析。,SYBRGreenI染料法,SYBRGreenI荧光染料在PCR过程中染料与DNA结合发光。,PCR反应体系的建立及优化,SYBRGreen使用浓度:太高：抑制Taq酶活性，太低：荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物决定其他与常规PCR相同,SYBRGreen法优缺点,（2）TaqMan法,TaqMan探针(TaqManProbe)水解型杂交探针TaqMan探针是一段被设计成可以与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA(50-150bp)。5-3-端带有短波长和长波长的两个不同的荧光集团，因两个基团的距离很近，在荧光共振能量转移的作用下会发出荧光粗灭。,荧光共振能量转移技(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET),检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具,检测某一细胞中两个蛋白分子是否存在直接的相互作用。,TaqMan探针的三个要素,1）一端的短波长的荧光集团2）一段目的DNA特异碱基序列3）一段长波长的荧光集团。,TaqMan法,5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有53外切核酸酶活性，可水解探针,TaqMan探针定量原理,TaqMan法PCR反应的建立,1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70，30bp,5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为59-60、2、反应参数的确定：一般为：95,3min94，15S60，60S（Taq酶53外切酶活性在60最高也可通过温度梯度优化退火温度）3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同,40cycles,Taqman法优缺点,五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定位的一种细胞化学技术。步骤:同位素标记的生物大分子前体掺入；细胞内同位素所在位置的显示。,六定量细胞化学分析技术,利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。包括：紫外光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法流式细胞仪（FlowCytometry）主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。,第三节细胞培养、细胞工程与显微操作系统,一、细胞培养动物细胞培养类型：原代培养细胞(primaryculturecell)：取下细胞、组织的器官后立即进行培养(1-10代以内)。传代培养细胞（sub-culturecell）：适应在体外培养的持续传代培养的细胞。,细胞株(cellstrain):正常二倍体，接触抑制细胞系(cellline):亚二倍体，接触抑制丧失，色体明显改变，容易传代培养。常用的细胞系：Hela细胞系(子宫颈瘤细胞)BHK21(Babyhamsterkidney)CHO(chinesehamsterovary)*培养细胞一般不保持体内原有细胞形态，存在形态：成纤维样细胞(fibroblastlikecell)上皮样细胞(epitheliallikecell,培养方法：贴壁培养，悬浮培养原代培养的步骤：取组织块，剪碎，消化分散细胞连接处(胰酶或EDTA)，无菌、培养液中培养。细胞系(Cellline)：在培养条件下可进行无限分裂的动物或植物细胞群。细胞株(Cellstrain):通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志(Marker)的培养物称为细胞株，细胞株的特定性质功标志必须在整个培养期始终保持。,贴壁培养:分散的细胞悬浮在培养瓶中很快(几十分中至几小时)就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁，贴壁后的细胞形态形成多态，呈单层生长，所以此法又叫单层细胞培养。单层培养的细胞保持接触抑制特性。悬浮培养:悬浮培养的细胞在培养过程中不贴壁，一直悬浮在培养液中生长。如T细胞的培养。悬浮培养条件较为复杂，难度也大一些，但是容易同时获得大量的培养细胞。,植物细胞类型：单倍体细胞培养（花药培养）原生质体培养（体细胞培养）非细胞体系（cell-freesystem）,二、细胞工程,细胞分化的定向诱导：基因工程组织工程细胞融合：杂种细胞单克隆抗体显微注射克隆动物,2.细胞融合技术：,长命不分泌抗体,分泌抗体短命,分泌抗体长命,(Khler和Milstein,Jerne),1984年Nobel生理学及医学奖,3.杂交瘤细胞的筛选：,脾细胞(B淋巴细胞),骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞,脾细胞/脾细胞,骨髓瘤细胞/骨髓瘤细胞,骨髓瘤细胞,脾细胞,筛选出,不能长期存活,不能长期存活,HAT培养基筛选原理,DNA,内源性途径(主要途径),谷氨酰胺or单磷酸尿苷酸,A,H,T,(HypoxanthineGuzninePhosphoribosylTransferase)次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT),胸腺嘧啶激酶(Thymidinekinase,TK),B淋巴细胞：HGPRT+，TK+,骨髓瘤细胞：HGPRT-，TK-,存活,死亡,外源性途径(旁路途径),在多孔塑料板孔内培养单个细胞(HAT培养液),培养2周,杂交瘤细胞可继续繁殖,优良杂交瘤细胞,检测单克隆抗体,接种动物,大量生产单克隆抗体,细胞大量培养罐大量生产克隆抗体,冷冻保藏,淘汰不合格的细胞,亲代死亡,使用与蛋白质或脂质藕联的亲脂性或亲水性的荧光分子,如GFP,LUC等检测活体表面或细胞内部的分子运动以及各种结构上分子动态变化率的大小。原理：利用高能量激光束的照射使特定区域的荧光不可逆的猝灭。光漂白的恢复可通过非漂白区的荧光分子在膜上或胞质中运动至光漂白区来完成。,一、荧光漂白恢复技术(Fluorescencerecoveryafterphotobleaching,FRAP),第四节细胞及生物大分子的动态变化,二、酵母双杂交系统（Yeasttwo-hybridsystem）,真核生物转录调控因子具有组件式结构（modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域。其中DNA结合结构域（bindingdomain，BD）和转录激活结构域（activationdomain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。,DNA结合结构域（BD）能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录。由不同转录调控因子的BD和DNA转录激活结构域AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。,酵母