细胞生物学研究方法 1

,Preparatoryobserve,putforwardtheories,Designcontroltests,Collectdata,Explainresults,Deviseconclusion,Refertoknowledge,第二章细胞生物学研究方法,一.显微成像技术二.细胞工程技术三.细胞组分的分离技术四.细胞组分的分析方法,内容提要,一、光学显微镜,分辨力(resolution)是指能够区别开的两个质点的最小距离。分辨力的最终限度是决定于光的波长。对任何显微镜而言，最重要的是分辨力，而不是放大倍数。,分辨率(resolution，R)：,R=0.61/(nsin/2)R=0.61x0.5/1.5=0.2m,Interferencebetweenlightwaves.Whentwolightwavescombineinphase,theamplitudeoftheresultantwaveislargerandthebrightnessisincreased.Twolightwavesthatareoutofphasepartiallycanceleachotherandproduceawavewhoseamplitude,andthereforebrightness,isdecreased.,Edgeeffects.Theinterferenceeffectsobservedathighmagnificationwhenlightpassestheedgesofasolidobjectplacedbetweenthelightsourceandtheobserver.,m(micrometer)=10-6mnm(nanometer)=10-9m(ngstrmunit)=10-10m,a.普通光学显微镜,取材固定脱水包埋切片脱蜡复水染色脱水透明封片观察,b.荧光显微镜,Fluorescentdyes.,荧光黄,四甲基罗丹明,Fruitfly(Drosophila)embryo,c.激光共聚焦扫描显微镜,Comparisonofconventionalandconfocalfluorescencemicroscopy.Thesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothathasbeenstainedwithafluorescentprobeforactinfilaments.,d.相差显微镜,Twowaystoobtaincontrastinlightmicroscopy,Fourtypesoflightmicroscopy.(A)Theimageofafibroblastincultureobtainedbycommonlightmicroscopy(B)phase-contrastmicroscopy,(C)differential-interference-contrastmicroscopy,and(D)dark-fieldmicroscopy.,E.Electronicimageprocessing,Limitofresolutionoftheelectronmicroscope.Electronmicrographofathinlayerofgoldshowingtheindividualfilesofatomsinthecrystalasbrightspots.Thedistancebetweenadjacentfilesofgoldatomsisabout0.2nm(2).,二、电子显微镜,光镜与电镜的基本区别,电镜技术的基本特点1）电子束照明系统，包括电子枪、聚光镜。电子束比可见光的波长短得多，提高了分辨力。2）电磁透镜成像系统聚焦成像。3）真空系统：电子运行中如遇到气体分子将会被散射，所以电镜镜筒中要求高真空。4）记录系统：电子像是人眼看不到的，因此要用荧光屏来显示或感光胶片作记录。,电镜种类,1.透射电子显微镜2.扫描电子显微镜,Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalions.,Immunogoldelectronmicroscopy.,1.超薄切片（4050nm）。2.固定包埋切片染色等过程要求高。3.重金属盐染色或喷镀，以形成不同程度的反差，提高分辨力。4.负染技术5.冰冻断裂和冰冻蚀刻技术,电镜技术的基本要求：,SpecimenPreparationforElectronMicroscopy,Chemicalfixation,Diagramofthecoppergridusedtosupportthethinsectionsofaspecimeninthetransmissionelectronmicroscope.,Electronmicrographsofindividualmyosinproteinmolecules,MetalShadowingAllowsSurfaceFeaturestoBeExamined,Electronmicrographofnegativelystainedactinfilaments.,Freeze-fractureelectronmicrographofthethylakoidmembranesfromthechloroplastofaplantcell.,Freeze-FractureandFreeze-EtchElectronMicroscopy,Regulararrayofproteinfilamentsinaninsectmuscle.,Scanningelectronmicroscope(SEM),ImagesofsurfacescanbeobtainedbySEM;Critical-pointdrying;Range:15150,000X.Resolution:5nm,Scanningelectronmicrographofthestereociliaprojectingfromahaircellintheinnerearofabullfrog(A).Thesamestructureisshownbydifferential-interference-contrastlightmicroscopy(B)andbythin-sectionelectronmicroscopy(C).,细胞工程技术,一、细胞培养二、细胞融合三、显微操作,细胞培养（cellculture）,概念是指从活体中取出的细胞或其他建系细胞，在体外给予一定的条件进行培养，使其能继续生存、生长和繁殖的一种方法。,细胞培养的用途,1）直接观察活细胞的形态、结构和生命活动的过程。2）直接施加物理、化学和生物因子，观察对细胞影响。3）可将不同种类的细胞混合培养，研究细胞间的相互作用。4）配合其他的实验技术可作大量的研究工作，如细胞周期与调控、细胞衰老等。5）为植物育种开辟新途径，为疫苗生产、药物研制提供新手段。,细胞培养的条件,1）温度2）pH值3）营养物质4）无菌条件,A.动物细胞培养B.植物细胞培养C.非细胞体系D.细菌的培养E.病毒的培养,细胞培养的种类,动物细胞培养的特点,1）能显示来源组织的分化特征。例如：成纤维细胞仍能分泌胶原;神经细胞伸展出具有电兴奋作用的轴突。2）可从组织的不同类型的细胞混合群体中纯化某种类型的细胞，便于单因素的分析。3）取材容易，使用方便。,细胞培养的方法,1）贴附型：能在玻璃或塑料瓶壁上平展生长，形成单层细胞层。如上皮型细胞、成纤维型细胞等。,2）悬浮型：不贴附于支持物上，呈悬浮生长，胞体呈球形。如淋巴细胞等。,原代培养和传代培养,原代培养（primaryculture）1）概念直接取材于有机体组织的细胞培养。,2）步骤取材剪碎胰酶消化将细胞分散置合适的培养基培养，一般数小时即可贴壁生长、增殖，直到相互接触铺满瓶壁，形成单层细胞。第一代细胞称为原代细胞。,传代培养（secondaryculture）：将原代培养的细胞取出，转移到另一盛有新鲜培养液的器皿中进行培养的过程称传代培养。用这种方法可重复传代。,细胞系(cellline),概念培养的细胞中产生了具有无限繁殖能力的变异细胞，这种细胞可被无限地传代，称为细胞系,常用细胞系：,细胞系细胞类型来源3T3成纤维细胞小鼠BHK-21成纤维细胞仓鼠Hela上皮细胞人宫颈癌PTK1上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠SP2浆细胞小鼠,植物细胞培养,A单倍体培养B原生质培养,Preparationofhybridomasthatsecretemonoclonalantibodiesagainstaparticularantigen(X).,MonoclonalAntibodies,Thetechniqueforthetakeapartandgatherupofcell,andmicroscopemanipulation,Transgenicmice10weeks44gand29g,Methodstointroduceamembrane-impermeantsubstanceintoacell.,GeneKnockoutmice,MarioCapecchi(Late1980s)(UniversityofUtah)embryonicstemcellsininnercellmassastargetcells1/104cellsundergoaprocessofhomologousrecombination.,Step-by-stepprocedureforthepurificationoforganellesbydifferentialcentrifugation.,1.差速离心（differentialcentrifugation）,差速离心在密度均一的介质中，不同大小的颗粒沉降速度不同，大颗粒沉降快，先到管底，逐步加大离心力，延长离心时间，可分离细胞的不同组分。,组织匀浆,沉淀小块含整个细胞核和细胞骨架,低速离心1000g10min,将上清中速离心20000g20min,沉淀小块含线粒体、溶酶体、过氧化物酶体,沉淀小块含微粒体小泡,将上清高速离心80000g1小时,沉淀小块含核糖体、病毒、大分子,将上清超高速离心150000g3小时,2.密度梯度离心(densitygradientcentrifugation),在离心管中制备由上到下逐渐增加密度的蔗糖溶液（5%20%），形成密度梯度，细胞匀浆放最上面，这样不同组分以不同速率沉降，形成不同的沉降带，分别收集，进行分析。,密度梯度离心,Theseparationofsmallmoleculesbypaperchromatography.,3.Paperchromatography,Theseparationofmoleculesbycolumnchromatography.,4.Columnchromatography,5.chromatography,细胞组分的分析方法,一、组织化学和细胞化学法二、免疫化学法三、分子细胞生物学技术,金属沉淀法福尔根(Feulgen)反应联苯胺反应脂溶染色法茚三酮反应,一、组织化学和细胞化学法,二、免疫化学法,蛋白印迹法(westernblot),SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis,SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis(SDS-PAGE).,（一）DNA序列分析（二）核酸分子杂交技术(RNA)Northernblot,(DNA)Southernblot（三）聚合酶链式反应技术（PCR)（四）放射自显影术,三、分子细胞生物学技术,双脱氧链末端终止法测序原理示意图,PCR反应过程示意图,InsituhybridizationforRNAlocalizationintissues.,TracingandAssayingMoleculesInsideCells,3H-白氨酸脉冲追踪实验胰腺细胞的白氨酸5分钟对照,荧光检观察的细胞内Ca2+浓缩过程,Fluorescentanaloguecytochemistry.Fluorescencemicrographoftheleadingedgeofalivingfibroblastthathasbeeninjectedwithrhodamine-labeledtubulin.显示成纤维细胞的微管蛋白,其他的细胞生物学技术,Afluorescence-activatedcellsorter.,流式细胞计数仪,Freeze-etchelectronmicroscopy,冰冻蚀刻电子显微镜使用,Figure3-33.Theproductionofhybridcells.Humancellsandmousecellsarefusedtoproduceheterocaryons,whicheventuallyformhybridcel