第三章细胞生物学研究方法课件

第三章细胞生物学研究方法,第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞组分的分析方法第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术（单独一章讲）,研究技术、研究工具,显微镜的出现细胞学说的建立电子显微镜技术进入超微与分子形态水平超离心技术细胞成分、代谢过程的同位素示踪技术精确定性、定量分析单克隆抗体、分子杂交生物工程,可见范围,肉眼,光学显微镜,电镜,病毒,原核细胞型,真核细胞型,人眼100um,1cm,1mm,100um,10um,1um,100nm,10nm,1nm,0.1nm,光学显微镜,电子显微镜,扫描隧道显微镜,细菌,病毒核糖体,球蛋白,原子,植物、动物细胞,第一节细胞形态结构的观察方法,一、光学显微镜技术二、电子显微镜技术三、扫描隧道显微镜四、冰冻断裂（冰冻蚀刻技术）,一、光学显微镜技术,1、普通复式光学显微镜技术2、荧光显微镜技术3、激光共焦点扫描显微镜技术4、相差和微分干涉显微镜技术,1、普通复式光学显微镜技术,1）光学显微镜的组成,光学放大系统,照明系统,机械和支持系统,目镜,物镜,光源,折光镜,聚光镜,（滤光片）,2）分辨率,指区分开两个非常靠近的物体（或点）的能力,D=,0.61,N.Sin/2,：光源波长：物镜镜口角（最大值可达140度）N：介质折射率（空气中为1）,最短的可见光为450nm，若在油镜下，N可提高到1.5，因此：D=0.2um(光学显微镜最大分辨率),3）、样品制备（光镜）,取材：固定：用甲醛或乙醇包埋：石蜡切片：5um染色：不同的染料对某种细胞组分有特异的吸附观察,2、荧光显微镜技术,应用于对特异蛋白质等生物大分子定性定位。,1）分为：,免疫荧光技术,荧光素直接标记技术,2）原理：（以免疫荧光技术为例）,特定抗原（细胞）,抗体,抗体抗原复合物,进行定位测定,荧光素,激发光,不同的荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上的荧光素,（如：紫外线）,3）局限性：固定剂常会破坏抗原性；包埋剂常会产生自发荧光。,3、激光共焦点扫描显微镜技术,原理：是由一个激光扫描显微镜在物镜的成像面上加一个针孔组成，只有被照亮点发出的光才能通过共焦孔，偏离这一点的无用的荧光就被排除在最终的图像之外；物镜和聚光镜同时聚焦到同一各小点，即它们互相共焦点，极大的增加了对比度；通过“光学切片”和计算机进行图像处理得到样品的三维结构。效果：使观察到的图像反差和分辨率提高,激光共焦点扫描显微镜的原理图,4、相差和微分干涉显微镜技术,发明：19341935荷兰物理学家Zernike设计和发明相差显微镜，并获得诺贝尔奖。原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构之间的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。优点：样品不需染色，可以观察活细胞。,相差：在某一时间上，光的波动所能达到的位置，便是它的相位；两组波的相位不同，即相差。,x,y,透明玻璃,产生相位差,产生振幅差,Z,有明暗之分,吸光物质,结构,聚光器或光源上增加一环形光阑，使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上；物镜后装有一块“相差板”，相差板上涂有特殊物质；偏斜和未偏斜的两组光线之间增添了新的光程差，从而对样品密度的不同造成的相位差起“夸大”作用；,吸光区,半透明圆环,不透明的涂漆部分,透明的环状部分,二、电子显微镜技术,1、电子显微镜的基本构造,电子束照明系统：,电子枪,聚光镜,成像系统,物镜,中间镜,投影镜,真空系统,记录系统,2、电子显微镜与光学显微镜的基本区别,P52表31,电子波长0.010.9nm，分辨率0.1nm,光波长200nm700nm,3、超薄切片技术,切片厚度一般仅为4050nm,固定：锇酸（OsO4）和戊二醛等；包埋：环氧树脂；切片：染色：重金属盐；,三、扫描隧道显微镜,原理：（通常在低压下，二电极之间有很大的阻抗，阻止电流通过，称为势叠）当二电极之间近到一定距离（100nm以内）时，电击之间产生了电流，称为隧道电流，并且隧道电流和针尖与样品之间的间距呈指数关系。特点：1.原子尺度的高分辨率；2.可在真空、大气、液体等多种条件下工作；3.非破坏测量；,扫描隧道显微镜,四、冷冻断裂蚀刻技术,示意图,基本操作过程：,将标本在标本台上于1000C的冰中和1960C的液氮中超低温冰冻；用冷刀将冻结的标本骤然断开；当温度上升后，冰在真空条件下迅速升华，断裂面上的结构得以暴露（蚀刻）；再喷涂上一层蒸气碳和铂；将组织溶解掉，把喷涂上的碳和铂的膜剥离下来（复膜）；电镜观察。,第二节细胞组分的分析方法,一、从组织中分离出不同类型的细胞二、细胞器与生物大分子的分离三、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法四、特异蛋白抗原的定位与定性五、细胞内特异核酸序列的定位与定性六、定量细胞化学分析技术,一、从组织中分离出不同类型的细胞,第一步：破坏细胞外基质及细胞连接用蛋白水解酶（胰蛋白酶、胶原酶）用EDTA（乙二胺四乙酸）处理组织，再轻度机械振荡，使之成为单细胞。第二步：用各种方法从混合的细胞群体中分离不同类型的细胞通过沉降和离心利用抗体流式分选,二、分离细胞器与生物大分子,差速离心密度梯度离心,密度梯度离心法,将要分离的细胞组分小心地放在密度逐渐增加，高溶解性，惰性的物质表面，然后进行离心。不同组分以不同速率沉降，形成不同沉降带，从而得以分离。,密度梯度离心法与差速离心法,流式分选仪,2000V,2000V,高压偏转板,充以正电的小水滴,充以正电的小水滴,分别收集细胞,激光,排列成单列的细胞通过激光束时，仪器可测定出标记细胞上的荧光强度；仪器使带有荧光细胞的小水滴充电；带电水滴通过高压偏转板偏离原来方向，收集细胞；未含标记的细胞或不含有细胞的水滴不偏转