第二章--细胞生物学研究方法

第二章细胞生物学研究方法,METHODSANDTECHNIQUES,第一节细胞学形态结构的观察方法,一、光学显微镜技术普通光学显微镜相差显微镜微分干涉显微镜暗视野显微镜荧光显微镜激光扫描共聚焦显微镜二、电子显微镜技术透射电镜技术扫描电镜技术三、扫描隧道显微镜技术,（一）普通光学显微镜,1.构成：照明系统光学放大系统机械装置2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。,一、光学显微镜技术,3.分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。(肉眼、光学显微镜、电子显微镜的分辨率分别为0.2mm、0.2m和0.2nm)光学显微镜的分辨力R=0.61/NA其中为入射光线波长；NA为镜口率sin/2，n=介质折射率；=镜口角（样品对物镜镜口的张角）光学显微镜理论放大倍数可以达到1500倍，但由于受到可见光光源衍射效应的限制，其有效放大倍数只能达到1000倍。,1.用于观察活体细胞；2.特殊之处：环形光阑：位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。环形相板：在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。3.原理把光程差变成振幅差，提高了各种结构间的对比度，使其清晰可见。,（二）相差显微镜,莱卡相差显微镜（物镜与照明系统颠倒）,用途：适用于观察活细胞和活组织，是体外细胞和组织培养不可或缺的工具。,DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）,1.利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，与相差显微镜相比，分辨率更高，图像立体感更强。其优点是能显示结构的三维立体投影影像。2.使细胞的细微结构，特别是一些较大的细胞器，如细胞核、线粒体等立体感增强，适合显微操作。常应用于基因注入、核移植、转基因等操作。,（三）微分干涉显微镜,（四）暗视野显微镜,1.原理：与来自缝隙的一束强光通过暗室时可清楚地看到其中细微灰尘现象相同。在漆黑的视野中，由于反差增大了，使样品显得更清楚。（丁达尔效应）2.用途：观察生活细菌及细菌运动；鉴别细胞的死活；观察细胞核、线粒体等细胞器与细胞中的线状结构，以及单细胞有机体、硅藻、放线菌类；此外还可用来观察娇弱的微生物。,（五）荧光显微镜,1.原理：2.特点：照明方式通常为落射式光源为紫外光，波长短，分辨率高于普通显微镜有两个特殊的滤光片3.应用：通常与免疫荧光细胞化学结合，对细胞内的物质进行定性和定量的研究。,荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）,细胞形态观察、细胞内生化成分定性定量分析,（六）激光共聚焦扫描显微境,用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。扫描不同层次，显示细胞样品的立体结构。用途类似荧光显微镜，但能改变焦点获得样品不同切面上的图像，叠加后便可重构样品的三维结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍，比荧光显微镜分辨率高1.41.7倍。,（七）当代显微镜的发展趋势,采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。,二、电子显微镜技术,（一）扫描电镜技术1.工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大显示出与电子束同步的扫描图像。2.应用：观察样品标本的表面结构。图像为立体，反映了标本表面的真实结构。（与透射电镜比较）,Scanningelectronmicroscope（SEM）,SEMLIGHTPATHWAY,Scanningelectronmicrographofthestereociliaprojectingfromahaircellintheinnerearofabullfrog（牛蛙内耳毛发细胞）(A).Forcomparison,thesamestructureisshownbydifferential-interference-contrastlightmicroscopy(B)andbythin-sectionelectronmicroscopy(C).,Scanningelectronmicrographofratfibroblastsgrowingontheplasticsurfaceofatissue-culturedish.,（二）透射电镜技术,透射电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样。用于观察样品内部亚显微结构或超微结构。,电镜与光镜的比较,2.光镜与电镜的主要区别,光源不同：光镜为可见光或紫外线；电镜为电子束透镜不同：光镜为玻璃；电镜为电磁透镜真空：电子束运动轨迹不受空气干扰；空气对样品的污染；灯丝的氧化损伤。显示记录系统,第二节细胞组分的分析方法,一、离心分离技术差速离心技术密度梯度离心技术二、细胞化学技术酶化学技术免疫细胞化学技术放射自显影技术三、定量细胞化学分析技术显微分光光度测定技术流式细胞术,一、离心技术,分离细胞器及各种大分子基本手段。转速为1025kr/min的离心机称为高速离心机。转速25kr/min，离心力89Kg者称为超速离心机。沉降系数：当颗粒受到的净离心力（离心力与浮力之差）与溶剂的摩擦阻力达到平衡时，单位离心场强度的沉降速度。,（一）差速离心Differentialcentrifugation,1.原理：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。2.特点介质密度均一速度由低向高，逐级离心。3.沉降顺序核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。4.可将相差悬殊的细胞和细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。,Thepreparativeultracentrifuge（超速离心机）.,Ingeneral,thesmallerthesubcellularcomponent,thegreateristhecentrifugalforcerequiredtosedimentit.lowspeed:1,000timesgravityfor10minutesmediumspeed:20,000timesgravityfor20minuteshighspeed:80,000timesgravityfor1hourveryhighspeed:150,000timesgravityfor3hours,（二）密度梯度离心,1.原理：用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。2.类型：速率区带离心、等密度梯度离心。3.常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。4.分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）pH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。,速率区带离心：介质密度小于分离物质的密度生物颗粒，细胞或细胞器在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离；等密度梯度离心：介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。,二免疫细胞化学,1.原理：根据抗原与抗体特异性结合的特点，检测细胞内某种多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。过程包括特异性抗体的制备；抗体的标记；标记抗体与标本孵育；显微镜下观察多肽或蛋白质的分布。2.分类：根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术免疫铁蛋白技术免疫酶标化学技术免疫胶体金技术等,（三）放射自显影术,1.原理：将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量。2.应用：用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出，以及合成、更新、作用部位等。,四、流式细胞技术,1.原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。2.应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。,应用举例：人类基因组测序：将分离荧光标记的染色体，进一步建立基因图谱。奶牛性别决定：分离所需的细胞,第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术,一、细胞培养当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程最基本的实验技术。主要包括原核生物细胞，如细菌；真核单细胞生物，如酵母、四膜虫等；植物细胞与动物细胞培养以及病毒的培养。（一）动物细胞培养1.类型：原代培养：从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。（第1代10代以内）传代培养：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程。（第10代50代以内）,2.细胞株：仍保持原来染色体二倍体数量，以及接触抑制行为。3.细胞系：染色体发生明显改变，呈亚二倍