重组DNA技术与基因组学(ppt 49页).ppt

第十七章重组DNA技术与基因组学,第一节DNA序列测定第二节重组DNA技术的基本操作原理第三节重组DNA技术的应用第四节基因组学和蛋白组学及研究技术简介,DNA测序的基本策略,设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。双脱氧末端终止法化学法测序技术进展,DNA测序的基本策略,设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过高分辨率的电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开，根据DNA片段长短排列顺序及其末端碱基就可读出待测DNA的碱基序列。双脱氧末端终止法化学法测序技术进展,有相同的起点,不同终点的一套DNA片段示意图,电泳图谱,双脱氧末端终止法测序原理,酶反应,电泳方向,5,3,引物,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddATP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddTTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddGTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddCTP,GGCCA,GGCCATCGTTGA,GGC,GGCC,GGCCATC,GGCCATCGTTG,GGCCATCG,GGCCAT,GGCCATCGT,GGCCATCGTT,ACGT,GGCCATCGTTGA,GGCCATCGT,GGCCATCGTTG,GGCCATCGTT,GGCCATCG,GGCCATC,GGCCA,GGCCAT,GGCC,GGC,双脱氧末端终止法（Sanger测序法）,dNTP,反应混合物,Klenow酶,未知序列的单链DNA,CTGACTTCGACAAAGAA,5,3,放射性标记的引物,TGTT,DNA的测序仪示意图,computeranalysis,凝胶中DNA移动方向,样品槽,激光器,输入光学系统,成象透镜,聚焦透镜,高灵敏度相机,旋光镜/棱镜组件,DNA的化学测序示意图,反应试剂G反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸T+C反应：肼C反应：NaCl+肼,测序技术进展同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳,多色荧光标记毛细管电泳,单色荧光标记平板电泳,同位素标记平板电泳,A,C,G,T,A,C,G,T,测序图谱,TATTGCATTGTCTGCATTGTCT,引物标记法测序(DyePrimer),一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。,反应结束后，将4管反应液混合，经乙醇沉淀后上样,终止法测序(DyeTerminator),一个样本，1个反应。反应中包含分别带4色荧光标记的ddNTP(终止子),unlabeledprimer,templateDNA,+,AmpliTaqFSdATP,dCTP,dGTP,dTTP,ddCTPddATPddGTPddTTP,测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进行纯化，除去过量的ddNTP后上样。,第二节重组DNA技术的基本操作原理,重组DNA是基因工程的核心技术，即把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。,一、DNA重组技术重要的工具酶二、重组DNA技术的基本操作原理,返回,一、重组DNA的重要的工具酶,1、限制性内切酶2、DNA连接酶3、逆转录酶,常用的DNA限制性内切酶的专一性,酶,辨认的序列和切口,特点,AGCTTCGA,GGATCCCCTAGG,AGATCTTCTAGA,GAATTCCTTAAG,AAGCTTTTCGAA,GTCGACCAGCTG,CCCGGGGGGCCC,BamHI,AluI,BglI,EcoRI,Hind,SalI,SmaI,四核苷酸，平端切口,六核苷酸，平端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,连接酶连接切口,Mg2+,连接酶,T,C,P,T,T,P,P,P,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,缺口,3,5,5,5,3,3,模板链,模板链,反转录酶的三种催化功能,重组DNA技术基本操作原理,1、目的基因的获取2、载体的构建3、目的基因与载体的重组4、重组体导入宿主细胞进行扩增5、筛选克隆细胞,目的基因的获取,1、建立DNA和cDNA文库2、体外扩增PCR技术3、人工合成,重组DNA技术路线1,基因文库(DNAlibrary),基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。应用DNA重组技术，可以将各种生物体全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其为genomiclibrary。,cDNA文库（complementalDNAlibrary）,将细胞全部mRNA反转录成cDNA并被克隆的总和称为cDNA文库。,基因文库和cDNA文库的建立,可克隆之DNA,载体,DNA,cDNA,mRNA,部分或完全酶解DNA,DNA长度分级,甲基化，双链接头DNA,DNA与载体连接,引入大肠杆菌,鉴定文库的滴度和特性,扩增后供长期储存,筛选出所需要的克隆,组织,DNA克隆的载体,1、质粒2、噬菌体3、动物病毒4、植物寄生菌,重组DNA技术路线2,重组DNA转移技术,1、转化(transformation)：以质粒为载体构建的重组DNA分子导入受体细胞的过程。2、转染(Transfection):以噬菌体或真核病毒为载体构建的重组体依靠对细胞的感染功能导入受体细胞的过程。3、电穿孔法(electroporation):高压脉冲电流使细胞产生临时的通透性以吸收DNA。4、微注射法(microinjection):借助极细针管的帮助把DNA注射入细胞核的方法。,重组DNA技术路线4,电穿孔法示意图,细胞壁,原生质膜,纤维素酶,电穿孔,细胞壁再生,瞬间的开口,外来的DNA,插入外源DNA的植物细胞,pBR322质粒的结构,噬菌体感染大肠杆菌的途径,噬菌体突变型作为克隆载体,DNA,用限制性内切酶除去中间一段,与外源DNA连接,重组载体的体外包装,带有外源DNA的噬菌体,太小不能被包装,反转录病毒的生活周期,RNA,衣壳,被膜,逆转录酶,植物冠瘿瘤,（其表达产物帮助T-DNA转移和整合）,鱆鱼碱Ti质粒结构,编码两类酶：植物生长激素和细胞分裂素合成酶冠瘿氨基酸或冠瘿碱合成酶,筛选克隆细胞,载体特征的直接筛选菌落的原位杂交免疫学方法,重组DNA技术路线5,pBR322质粒结构,如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活,如果外源DNA插入，四环素抗性基因失活,原位杂交法筛选DNA重组体图解,用NaOH将菌体裂解，变性的DNA转移到硝酸纤维素膜上,杂交,放射自显影,32P-cDNA,与放射性cDNA杂交的菌落的斑点,细菌菌落,单链DNA结合到膜上,将菌落复印至硝酸纤维素膜上,重组DNA表达产物的免疫学检测,32P-抗体,裂解细胞，表达蛋白转移到硝酸纤维素膜上,与放射性抗体杂交的蛋白质斑点,转化到E.Coli,细菌启动子,插入的真核DNA片段,放射自显影,重组体,Southern和Western印迹法,DNAfrangment,Electrophoresis,TransferofDNAbyblotting,32P-labledDNAprobe,Autoradiography,Agarrosegel,Autoradiogram,Nitrocellulosesheet,Autoradiogram,Polymersheet,SDS-Polyacrylamidegel,Transferprotein,Addradiolabledspesficantibody,Washtoremoveunboudantibody,Proteinbanddetectedbyspecificantibody,Autoradiography,第三节重组DNA技术的应用,一、产生新品种新选择转基因动植物构建微生物工程菌基因药物二、法医学的强大武器DNA指纹法三、基因诊断和治疗,胰岛素原的人工合成,胰脏,(A)n胰岛素原mRNA,cDNA,重组质粒,转化细菌,mRNA,反转录酶,胰岛素原基因,与质粒连接,转化E.coli,胰岛素原,Ti质粒为载体的植物基因工程,I二元载体系统,II共整合载体,IIIT-DNA的转移与整合,Ti辅助质粒,Ti辅助DNA给体质粒,Ti辅助DNA给体质粒,pBR型质粒（给体质粒）,宿主特异性,外源基因,宿主特异性,整合,带有外源基因的Ti质粒,植物DNA,Ti质粒转移并插入植物DNA,Southern印迹法在DNA指纹法中的应用,1DNA分子量标准物2犯罪嫌疑人13现场证据4犯罪嫌疑人2,Southern印迹法,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,第四节基因组学与蛋白质组学及研究技术简介,携带有细胞或生物机体的一整套遗传指令的核酸量称为基因组(genome)，在此基础上产生的基因组学(genomics)是一门在整个细胞、整个物种的基因水平研究DNA顺序、整个基因组成分和功能的科学。由一个基因组表达的所有蛋白质成分叫做蛋白质组（proteome），从整体水平研究蛋白质组的结构和功能即为蛋白质组学(proteomics)。,一、基因组文库提供基因组特异的遗传信息目录二、多聚酶链式反应扩增特异性的DNA片段三、基因组测序提供最完善的基因文库四、序列和结构相关性提供蛋白质功能的信息,返回,基因组文库提供基因组特异的遗传信息目录,DNA文库是是许多DNA克隆的集合，理论上基因组的所有DNA序列都能存在于基因组文库中。使用分子杂交的方法，可以在文库中找到先前已知的基因或顺序的位置，亦可用生物信息学（Bioinformatics）方法找出基因并研究其功能。在基因组文库中的已知顺序(称为标签顺序位点，sequence-taggedsite,STS)能够为基因组测序提供界标。,多聚酶链式反应扩增特异性的DNA片段,人类基因组工程以及对各种基因组测序的研究，为人们提供了前所未有的了解基因信息的好机会。这些DNA顺序信息又为简化单个基因的克隆以便更详细地进行生物化学研究提供了条件。如果知道一个被克隆的DNA片段的侧接顺序，就能利用多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)扩增这个DNA片段，这样扩增的DNA片段能直接用作目的基因或用于生物化学与分子生物学分析过程。该技术是KaryMullis在1984年发明的，主要是根据DNA复制的基本原则，用于特定DNA片段的体外扩增。,PCR技术原理示意图,PCR技术的发展与应用,末知序列的PCR扩增；将逆转录与PCR相偶联（RT-PCR）；用于DNA的测序；用于基因定位诱变；用于合成特异探针；基因组序列的比较研究；用于临床诊断。,基因组测序提供最完善的基因文库,人类基因组测序实施的成果不仅仅是获得生物学迅速发展的数据库，而且改变了人类对自身的思维；人类基因组DNA只有1.1%-1.4%用于编码蛋白质，独特的基因表达模式能使一个基因产生更多的蛋白质，这是人类和其他脊椎动物比细菌、蠕虫等简单生物优越的地方；在人类群体中大约有几百万个碱基的区别，即所谓单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)；这些微小的差异产生了人类个体的差异性。国际数据库中大量的数据信息不断增加，它们具有不可估量的价值。,人类基因组各种顺序组成图,序列和结构相关性提供蛋白质功能的信息,利用“比较基因组学”研究方法，能通过基因组DNA同源序列比对确定基因的功能；在一些蛋白质内可以找出特殊结构模序(motif)相关的DNA或氨基酸顺序，可以帮助鉴定蛋白质的分子功能；为了进一步进行基于结构相关性的蛋白质的功能鉴定，可尽可能多的获取还没有现有功能信息的蛋白质结晶，测定它们的结构和结构域，并将其纳入结构数据库，通过与数据库中已知功能蛋白质的模序比对来获取这些未知蛋白质的功能信息。,蛋白质技术和核酸技术的相互增强,插入表达载体,转化寄主细胞,推导出AA顺序,制备合成肽,制备对所编码蛋白专一的抗体,基因或cDNA,蛋白质,蛋白质,测定出AA顺序,合成cDNA探针,制备专一的抗体,沉淀核糖体分离mRNA,用Southern印迹法筛选DNA文库,基因或cDNA,DNA芯片(DNAchip)技术是采用寡核苷酸原位合成或显微打印手段，将