12 基因工程的基本操作程序

新课导入,外星来客？,虎蚕,白斑马,你是否相信？,普通玉米,有抗虫基因的玉米,1.2 基因工程的 基本操作程序,重点,难点,教学重难点,基因工程的基本操作程序的四个步骤 。,从基因文库中获取目的基因。,利用PCR技术扩增目的基因。,基因工程的基本操作程序,一、目的基因的获取,即：,（3）获得目的基因的方法：,1、从基因文库中获取目的基因,2、,利用PCR技术扩增目的基因,1.1什么是基因文库,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，成为基因文库。,1.2基因文库的种类,基因组文库：,部分基因文库(cDNA文库)：,含有一种生物的全部基因,含有一种生物的部分基因,1、从基因文库中获取目的基因,1.3基因文库的构建,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,某种生物的mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,逆转录,构建基因组文库,构建部分基因文库,1.4怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因,根据目的基因的有关信息，如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质的特性来获取目的基因。,2、利用PCR技术扩增目的基因,2.1 PCR技术(聚合酶链式反应)原理：,DNA双链复制的基本原理。,2.2 PCR技术反应前提：,PCR扩增仪,一段已知目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物。,引物？,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,DNA的两条链为模板,温度控制和缓冲液,2.2 PCR技术反应条件：,复性,延伸,目的基因DNA受热解成单链,变性,引物与单链互补结合,合成链受DNA聚合酶的作用,2.3PCR技术反应过程：,质粒,DNA分子,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA 连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种 限制酶,二、基因表达载体的构建,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,（1）重组质粒的形成：,载体的作用：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,（2）基因表达载体的组成：,有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。,将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,三、将目的基因导入受体细胞,（1）常用的受体细胞：,动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。,（2）将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞吸收DNA分子,（3）将目的基因导入受体细胞的方法：,3.1导入植物细胞,农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上。,农杆菌转化法,农杆菌转化法示意图,目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达,目的基因插入Ti质粒的T-DNA上,农杆菌导入植物细胞,整合到受体细胞的染色体上,农杆菌转化法,花粉管通道法,基因枪法,受精卵移植入输卵管或子宫,发育成具新性状的动物,3.2导入动物细胞,显微注射技术,将目的基因导入动物细胞,原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，故早期常作为受体细胞。,重组表达载体DNA溶于缓冲液,混合,转入,3.3导入微生物细胞,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交,抗原-抗体杂交,四、目的基因的检测与鉴定,分子检测,个体鉴定,没有抗虫基因的棉植株,有抗虫基因的棉植株,棉铃虫,虫没有死,虫被杀死,没有表达,基因表达,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,棉铃虫,课堂小结,目的基因的获取,获取能编码某种蛋白质结构基因,基因表达载体的构建,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下代，使目的基因能够表达,目的基因导入受体细胞,是目的基因进入受体细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程,目的基因的检测和鉴定,检测目的基因检测目的基因是否转录，并翻译成蛋白质。,1、 PCR技术扩增过程:,DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_ 。,复性（55-60）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部_。,延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,课堂练习,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目的基因，使其产生_。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组