HIV样品采集和处理

,HIV样品的采集和处理海南省皮肤病医院检验科,乔凤,2,主要内容,3,基本知识,HIV检测方法抗体检测、抗原检测、核酸检测、耐药检测、CD4+和CD8+T淋巴细胞测定、HIV分离培养样品的种类全血、血清、血浆、细胞、唾液、尿液、滤纸干血斑支持性文件:全国艾滋病检测技术规范(2009)、艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量保证指南(2006)、HIV-1病毒载量测定及质量保证指南(2008)、可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定(卫生部45号令，2006),4,基本知识,5,样品种类,HIV抗体检测：全血、血清、血浆、唾液、尿液、DBSCD4+和CD8+T淋巴细胞测定：抗凝全血病毒载量检测：血浆耐药、基因型检测：血浆、DBS核酸定性检测：全血、血浆、淋巴细胞、DBS分离培养：全血、淋巴细胞,6,抗病毒治疗的目标,病毒学目标：最大程度地减少病毒载量，将其维持在不可检测水平的时间越长越好免疫学目标：维持免疫功能，获得免疫功能重建和/或部分免疫重建终极目标：延长生命并提高生活质量,7,病毒载量与CD4+T计数,AIDS病程：一列迫近悬崖的列车病毒载量=火车的速度CD4+T计数=离悬崖的距离抗病毒治疗：制动火车的外力,8,病毒载量与CD4+T计数,9,病毒载量与CD4+T计数,10,HAART的目标,UltimateGoalofHAART,RelativeLevels,Months,YearsAfterHIVInfection,CD4+T-cells,PlasmaHIVViremia,AcuteHIVinfectionSymptom,Limitofdetection,11,HIV-1病毒载量检测,代表的是病毒的负荷，即体内复制的病毒的数量体内复制的病毒的数量是不能直接测量的，一般用血浆中RNA的拷贝数代表HIV的病毒载量简单来讲是通过测量从而显示每毫升血液里病毒的数量定量机体内游离病毒的含量,12,病毒载量检测的意义,急性HIV感染，窗口期复制高峰每毫升血液RNA拷贝可达9107，一年以后仍然可达2-4104判定病人疾病的进程和进展。血浆中病毒水平是病毒增殖和免疫清除机制共同作用的结果，CD4+T细胞越少显示病毒载量水平越高,13,病毒载量检测的意义,监测与指导抗病毒治疗过程，ART早期HIVRNA水平快速下降，并在相当长的一段时间维持在一个比较平缓的水平，大部分患者可以下降到检测不出的水平观察耐药性,14,HIV-1病毒载量检测方法,病毒载量检测主要有三种方法：bDNA、RT-PCR及NASBANASBA检测是通过核酸释放、提取、核酸扩增(NASBA扩增)及核酸检测来完成对血浆中HIV病毒RNA的定量测定生物梅里埃公司将NASBA核酸扩增技术与实验时(real-time)检测技术结合起来，“分子信标实时扩增检测技术”，能够对检测进行实时监控，即称为“EasyQ”,15,病毒载量检测样品采集运输保存,HIV-1，血浆样品EDTA抗凝真空无菌采血管全血5ml或3ml*2,采集的样品量应尽可能与定量采血管的刻度一致，采集量过多或不足，会造成血液凝固或被稀释。采集血液后，立即轻轻上下颠倒抗凝管约10次，使血液与抗凝剂充分混匀，避免剧烈振荡导致溶血,16,病毒载量检测样品采集运输保存,务必在采集全血的4小时内分离血浆，室温下1500-3000r/min离心15分钟送检血浆2管，每管1ml，冷冻(藏)运输血浆样本3天内送检可在2-8暂时保存，1个月以内应冻存于-20以下，1年以内应置于-70以下血浆样品冻融不应超过3次,17,病毒载量检测结果的解释,单位：copies/ml检测限：20cps/ml(0.5ml)；10cps/ml(1ml);100cps/ml(0.1ml)结果举例：20copies/ml(检测到HIV核酸，但是低于方法检测下限，无法定量)TND(未检出，使用现有的检测方法对本次样本未检测到HIV核酸),18,样品处理对病毒载量结果的影响,一般地讲，血浆中病毒载量水平比血清中的要高出3080用EDTA抗凝剂的采血管采集全血后分离血浆样本，其HIVRNA含量比ACD和肝素抗凝管相应含量多1015及2025,19,样品处理对病毒载量结果的影响,采集全血后的3-6小时RNA丢失量最大，血浆样本RNA丢失低于全血样本。1小时以内，EDTA抗凝管RNA丢失约10，ACD抗凝管丢失约20；6小时以内，肝素抗凝管RNA丢失约30。,20,样品处理对病毒载量结果的影响,血浆样本在-20冰柜保存3-14个月，与起始病毒载量水平值(0月)相比，3个月时变化没有显著性差异；6个月后下降值明显，有随着保存时间延长病毒载量水平下降幅度越大的趋势。在-20冰柜内保存6个月，样本病毒载量水平已不能真实反映样本采集之初的水平，对疾病进展和疗效评价，尤其对回顾性研究已无指导意义。,21,样品处理对病毒载量结果的影响,-20条件下冻融3次比冻融1次HIVRNA降低约20。许多研究者用多种检测方法和不同人群样本的研究结果证实，技术和生物因素对样本RNA水平的影响是持续的和可预测的，大约在0.3-0.6log/ml之间。,22,CD4+T淋巴细胞测定,进行性且选择性地消耗CD4细胞是HIV感染的特征。CD4细胞减少与机会感染增高相结合并且在个体感染HIV后病情呈进行性。CD4细胞残余数在临床预后治疗监测和新型抗逆转录病毒以及疫苗的临床试验入选标准工作中是最经常利用的实验室测量项目,23,CD4+T淋巴细胞测定,准确及时地对残留CD4细胞计数，不仅是评价性试验，也是对存活的HIV感染者实施治疗与关怀的一部分CD4细胞减少与机会感染增加和病情发展相联系CD4细胞计数为HIV感染临床分期、疾病进展监测、机会性感染的风险评估、抗病毒治疗适应症选择及疗效评价的实验室指标,24,流式细胞术(FCM),FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。,25,流式细胞术特点,单细胞的流动的活细胞的定量的多参数的高统计学精度的分选细胞,26,CD4+T淋巴细胞测定的方法,CD4+和CD8+T淋巴细胞计数的方法分为两大类，一类是应用流式细胞仪测定法，另一类是非流式细胞仪测定法常用的淋巴细胞计数检测方法为自动检测方法，包括流式细胞仪（主要有多平台法和单平台法）和专门的细胞计数仪,27,双平台法,双平台方法是一种细胞群体的绝对计数方法，利用血球计数仪检测淋巴细胞数量，再根据流式细胞仪得到的细胞群体百分比，计算得到每微升的淋巴细胞数量。双平台法需要两种仪器，由于仪器有系统误差，计算结果的重复性和准确性影响因素较多，导致不同实验室计数结果差异很大。最大的缺点在于操作步骤复杂，操作人员多、费时，因此很难将变异水平减小到最低。,28,单平台法,应用三色、四色流式试剂配以内参绝对计数微球，加上流式细胞仪淋巴细胞亚群获取和分析软件，一步即可获得T细胞亚群的相对数(百分比)和绝对数。单平台法最大程度地减少了多个仪器检测带来的检测误差，细胞绝对计数结果的重复性和准确性都得到了良好的保证。,29,CD4细胞计数样品的采集运输,抗凝全血K2EDTA/K3EDTA抗凝真空无菌采血管采样量：成人采集静脉血5ml，采集儿童静脉血样品建议用儿童型注射器和小试管(2ml)，采集婴儿样品较为困难，用小试管采集0.5-1ml即可样品混匀：采集的静脉血注入抗凝管后，立即轻轻颠倒抗凝管6-8次，使血液与抗凝剂充分混匀，防止血液凝固，避免剧烈振荡导致溶血,30,CD4细胞计数样品的采集运输,采血时间：鉴于CD4+T淋巴细胞数日间自然变化的个体差异，每一病人采样时间应尽可能集中在某个相同的时段运输条件：37以上的温度会破坏细胞，使血液学和流式仪的检测结果受到影响。因此应在室温(18-25)保存和运输样品，避免极端温度(结冰或大于37)。高温季节，需用隔热容器盛装样品，并将其置于有冰袋和吸热物质的容器中样品应存放于室温，不得冰冻保存，并且在24小时之内送达检测实验室,31,CD4细胞计数结果解释,CD4+T淋巴细胞是T辅助淋巴细胞。报告该值的正确细胞是CD3和CD4全部双阳性的细胞绝对计数和百分比。CD45阳性细胞是所有白细胞的计数