中科大FPLC使用参考

1.2 FPLC使用指南From : USTC|Date : 2016-12-01简介（INTRODUCTION）FPLC全称为快速蛋白液相色谱（Fast protein liquid chromatography），其原理与高效液相色谱理论类似，是由经典的液体柱层析引入气相色谱理论，并且对相体进行了改革，配用高压输液泵，采用高灵敏检测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和微机等发展起来的现代液相色谱。我们实验室有两套纯化仪，一台是AKTA prime plus（着重介绍），另外一台是AKTA pure protein(简单介绍）。AKTA Pure 纯化系统（详见AKTA Pure onsite-training）AKTA Prime Plus 纯化系统 安全(Safety) 组件(Components) 方法编程(Method programming) 使用方法(Usage) 维护注意事项(Maintenance)安全(Safety)1.警告！系统必须与接地电源插座连接。2.警告！用户不能打开系统，因为系统含高压电路，会造成致命的电击。3.警告！必须总有上样环连接在上样阀的接口2和6。这是为了在转换此阀时防止液体从这些接口喷出。尤其是使用危险化学品时，这是特别危险的。4.警告！如果有大量溢出的液体渗入系统外壳并同带电部件接触的危险，应立即关闭系统并同指定的技术服务人员联系。5.警告！NaOH有害健康，应避免泄漏。 组件（Components）AKTA prime plus蛋白质纯化系统包括下列部件：1.缓冲液阀和梯度转换阀(Buffer valve and gradient switch valve)： 缓冲液阀用于选择使用缓冲溶液，用于系统泵施加大的样品体积。梯度转换阀用于建立梯度。2.系统泵(System pump)：系统泵用于经系统运送液体，如样品或缓冲溶液。将液体经缓冲液阀、梯度转换阀或经上样阀进入流动通道。3.压力传感器(Pressure sensor)：压力传感器可以测量在位液体压力。还可用作压力保护装置。4.混合器(Mixer)：混合器用于混合两元梯度。以两步将溶液混合以得到最适宜的结果。混合器的体积可以选择。5.上样阀(Injection valve)：上样阀用于装加样环和用于将样品注射到柱上。6.检测器(Monitor)：检测器的目的是测量流出柱后液体的UV吸收、电导率和pH（任选）。用于这些测量的流动池安装在系统的右侧。7.具有分流阀的分部收集器(Fraction collector with flow diversion valve)：分部收集器用于将样品组分收集在管中供进一步分析。分流阀在废液和收集管之间转换流向。 方法编程（Method programming)主菜单概要Template该菜单出现在自检后启动时，用于运行予制的应用模板和法模板。RunstoredMethod用于运行用户编辑的运行方法ManualRun用于不使用方法,手工运行系统。ProgramMethod用于编辑用户专用方法。SetParameters用于对检测紫外(UV)、电导、pH、温度、和运转泵及混合器设置参数。Check用于检测系统内部参数，例如序列号、泵运行时间、和灯亮度。使用方法（Usage)利用AKTA Prime Plus洗脱镍柱中的蛋白（以5 mL镍柱为例）1.打开AKTA（机器背部左下角），将A泵和B泵用蒸馏水冲洗干净分别插入到Ni-binding buffer和Elution buffer中，并在Template中选择system wash，洗泵(大概五分钟）。2.system wash完毕后，先选择manual run，%B=0，pressure limitation=0.4 MPa，流速=1 ml/min。先将Ni柱底部接到探测器上，再将1号接线口接到镍柱上端（这样可以防止绿色线管扭曲），观察电脑屏幕待UV线、电导线平齐时End program。3.设定程序：流速3 ml/min，limit pressure为0.4 MPa设定breakpoint：0 ml：%B=4，set fraction size=020 ml：开始拉梯度，%B=4；开始收集样品，set fraction size 3 ml/tube80 ml：%B=60；同时也一直在收集样品，set fraction size3 ml/tube100 ml：%B=60（有时有些蛋白量很大或者延时出来，可以设这个程序，以防万一），set fraction size 3 ml/tubeEnd4.蛋白纯化结束后，要清洗AKTA泵内部溶液，方便下位同学使用，将A泵和B泵用蒸馏水冲洗干净插入到蒸馏水中，并在Template中选择system wash，洗A、B泵。用蒸馏水清洗完毕后如果长期不用机器，需要用20%酒精再次清洗系统泵。并将收集器上的玻璃管收拾干净，并用水清洗，放于管架晾干。（总之，意思就是：0 ml时所有的系统全部要求置零，0-20 ml区间跑4% elution buffer把杂蛋白洗下来。20-80 ml区间设定elution buffer的浓度从4%慢慢升到60%同时收集样品，80-100 ml区间用60%把剩余蛋白全部洗脱下来并收集样品，到达100 ml时停止。）5.蛋白质纯化图谱的保存与提取（1）保存：在电脑桌面打开prime view evaluation软件，打来文件夹，在里面按照时间顺序找到你蛋白质纯化图谱，然后点击file，选择save as将你的图保存在你的文件夹。（2）提取：点击file,选择export curves 选择01：UV和06：Conc并在Reduce number of samples中选择Reduce by1。点击保存，得到excel表格，并用Graphpad prism5做蛋白纯化图谱。关键步骤：1.提前看好转盘与滴液体的部分是否靠紧，否则不会自动收集样品。2.根据出来的峰对应的离心管取下来放在冰上，取60 l至1.5 ml Ep管，暂放在冰上，用于制备SDS-PAGE样品。3.根据峰的位置选择样品，一般会有30 ml左右，加入1 mM EDTA和2 mM DTT以及PMSF，下面的gel filtration可以用super loop上样。4.万一电脑显示器上不更新图谱了，可能是与电脑的连接断了，需要关了纯化仪，重启。5.样品收集器偶尔会出现跳管子的情况，受样品是要注意从头或从尾对一下管子。跑其他柱子也是一样。6.不要用蛮力摆动输送臂。松开固定输送臂按纽，并将臂升高。（如图示）7. 及时清理废液。（尤其过夜纯化蛋白时，要检查废液是否装满）利用AKTA Prime Plus过分子筛1.打开AKTA，将A泵用蒸馏水冲洗干净插入到gel filtration buffer中，并在Template中选择system wash，洗泵(大概五分钟）。并用gel filtration buffer手动或者程序设定清洗上样环。2.system wash完毕后，先选择manual run，%B=0，pressure limitation=0.4 MPa，流速=2 ml/min(根据不同分子筛设定流速）。先将AKTA上1号接线口湿接上部分子筛，此时观察柱子管道是否有气泡，如果有气泡那么应该将1号接口线湿接到分子筛尾部接口，待分子筛头部管道空气排清后再正过来接柱子，最后将柱子尾部接口接到探测器上。观察电脑屏幕待UV线、电导线平齐时End program。3.Super loop接上，6号出口线接super loop上面，下面出来接上2号口。4.设定程序（以30 ml样品和320 ml分子筛为例）：流速：2 ml/min，限压：0.4 MPa，A为gel filtration buffer，全程%B=0。0 ml：inject30 ml：load100 ml：load，set fraction size=8 ml/tube（此处的break point体积以各自的蛋白大小而定）400 ml：load，set fraction size=0End5.蛋白纯化结束后，要清洗AKTA泵内部溶液，方便下位同学使用，将A泵用蒸馏水冲洗干净插入到蒸馏水中,并在Template中选择system wash，洗泵。6.蛋白质纯化图谱的保存与提取（1）保存：在电脑桌面打开prime view evaluation软件，打来文件夹，在里面按照时间顺序找到你蛋白质纯化图谱，然后点击file，选择save as将你的图保存在你的文件夹。（2）提取：点击file,选择export curves 选择01：UV和06：Conc并在Reduce number of samples中选择Reduce by1。点击保存，得到excel表格，并用Graphpad prism5做蛋白纯化图谱。关键步骤：1.super loop上尽量不要有气泡，如果有气泡只能跟过镍柱一样快跑完时手动调成load。所有参数在跑的过程中都可以改动，因此虽然程序上接样是从100 ml-400 ml这么宽的范围进行收集，但根据实际情况可以自己调。2.Super loop中的样品如果只有30毫升，在设定程序时需要有所保留设定为29毫升，以免分子筛里进入气泡。3.在使用绿色上样管时，请用注射器吸取少量gel filtration buffer，打入到绿色上样管中(一是为了去除气泡，而是为了去除管内液体）。 维护注意事项（Maintenance )1.每天，除了连续使用外，当实验完成系统使用结束后，应尽可能避免保存在装载缓冲液状态过夜。尤以高盐浓度洗脱缓冲液为甚！假如，不能避免，则紧记次日尽早用System Wash Method完成以蒸馏水将系统彻底清洗，才予以保存或再更新使用其它缓冲液，再次投入使用进行实验操作。用蒸馏水将剩下的缓冲液彻底冲洗出系统，这步骤至关重要。此举不但可以避免缓冲液对系统造成腐蚀机会，或因使用高盐浓度缓冲液保存过久造成盐结晶等的堵塞，对系统构成不必要的损害和损耗。2.（我们机器没有pH探测器）任何时间当不使用系统时，绝不要将pH电极留在流动池里。请不应将电极以水保存，否则这将使电极末端的玻璃膜，因长期保持于工作狀况下，会加速老化，甚或变干。电极可作以下处理：从流动池卸下pH电极。先以蒸馏水冲洗一遍，轻拭水份后，使其末端以其合适溶液泡浸保存。建议使用之保存溶液为：1摩尔KNO3及pH值为4溶液（以1：1）的混合缓冲液。3.若数天或更长的时间不使用系统，除用蒸馏水彻底清洗系统外。取下柱和pH电极（任选件）。通过细管道替换柱，并安装虚拟pH电极（如果使用）。然后用20%乙醇再冲洗所有使用的管件通道和所有的流动池一遍，然后并以此将系统保存。(pH电极应先行处理，参看上面2节的说明）。UV流动池也可以如上所述地用蒸馏水冲洗然后用20%乙醇通过流动池。但如需要也可吹乾存放，重新放置上红的保护罩。在此并不建议使用压缩空气使之吹乾，因为其内可能含有油滴，造成污染。建议使用低压高纯氮气或憜性气体（如氩气等）。4.每月定期保养处理，或当发现假峰等问题出现时，可拆下柱子，并用适宜的毛细管道替换其位置，将所有的缓冲液入口管件置于1摩尔NaOH中，对所有的入口管件通路运行System Wash Method，以流速为每分钟1毫升，将整个系统充分冲洗若20分钟。然后立即用蒸馏水，以通条件将整个系统运行System Wash Method加以冲洗20分钟。5.当装配部分收集器出口管架时，应根据收集管的长度不同而使用不同的切换口。调整时可将出口管和管夹放在输送臂上的长度导向小孔上，将管夹底在孔外臂上，将出口管轻推向下到达导向孔的底部，然后上紧管夹螺母。此可确保出口管露出正确的长度，以免造成跳管或收集体积错误情况发生。6.一定要保持实验环境的清洁，当使用仪器时发现缓冲液