分子生物学在检验医学中的应用.ppt

分子生物学在检验医学中的应用，一、分子生物学在检验医学中的常用技术，一、PCR技术2、RT-PCR技术3、RFLP4、SSCP5、MSP6、序列决定，二、外源性疾病的检验和诊断：一、细菌、支原体、衣原体、寄生虫、病毒等二， SARS冠状病毒的分子生物学检测bnioouts/bno utas : seneatgaattaccaagtcatggttacantisenceragtcggtacagctacfragmentlength 195 bpbniins/bn iaas : senegagctattcgttcgantisensectgtagaaatcctagctggagfragmentlength 110 bps a R1 s/sa r1as : senecccttgttcttgccantisensatetatgagccacagfragmentlength 150 BP，二、内源性疾病的检测与诊断：1，临床基因突变酶的分子性质研究1 ) 采用PCR-SSSCP技术发现我国第一例LDH遗传变异病例的男性： LDH:75U/L (参考范围： 110-240U/L )，其馀生命指标在3年调查期间，LDH活力总处于较低水平，48-85U/L之间存在其他原因，如血液抑制剂、药物影响等通过计算红细胞中h、m亚基的比例，初步判断为h亚基突变，采用合成的7对引物分别扩增LDH基因中的7个外显子，采用SSCP电泳法与正常人相比，发现外显子4发生突变2 n 23 n 34 n 45 n 56 n 6，2 )对LDH-B和LDH-B亚基的遗传变异和检测结果的影响，可能是基因变异改变酶分子的构成结构，影响酶活性和酶的物理化学性质，给临床医生带来诊断陷阱。 由于不同疾病状态下相关组织器官释放的酶与期望的不同，患者血清酶活性不能完全反映各种疾病的状态，易造成误诊。 LDH-A基因突变类型_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _突变位置DNA氨基酸置换的影响335435433愚人节3533543353354335335335335353353535353353535353535433333愚人节5354333333愚人节3533543333333333愚人节3 54-a-171cga-tgaarg -Ter无意义突变A-328GAG-TAGGlu-Ter无意义突变A-81GAC-AACAsp-Asn外显子2丧失A-220AAA-GAALys-Glu电荷变化a-314cgt-tgtgtgarg-cys电荷变化A-20 GTTGT-TGTValVal-Val辅酶键A-213丧失2bp (CT ) 位移变异A-251为20bp位移变异335435433543353354353535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353 LDH-B基因突变位置DNA氨基酸置换在B-6AAA-GAALys-Gly电荷变化B-35GCC-GAGAla-Glu辅酶键B-1038bp重复位移突变B-131AGT-CGTSer-Arg辅酶键B-139为2bp(TC ) 影响丢失的代码变异B-1454bp重复代码变异B-147TAT-TAGTyr-Ter无意义变异B-171CGC-CCCArg-Pro基质键B-172TTT-GTTPhe-Val基质键B-173CGC-CACArg-HisP轴的稳定性b-176 编码变异B-320GAT-GTTAsp-Val电荷变化，3)CK变异对分子性质和酶活性的影响，病例56岁女性胸痛一天后出现急诊科心电图和临床症状的AMI实验室检查： LDH 6900 u/l (200-400 u/l ) LDH-1/LDH-21.72 ck37 u/l (15 ) l)ck-mb0u/l， RT-PCR结果表明外显子2残基54处A-GGAC-GGC天冬氨酸-甘氨酸位于酶结构的第4个-螺旋4 )突变酶组检测结果与常规组检测结果不同，结合临床研究发现突变酶检测结果与常规人有显着差异，即、 这类组发病前酶活性常低于正常人参考范围，发病时上升到正常人参考范围，这可能给临床医师的正确诊断带来困难，1 ) 2，2，电泳异常带来的分子性质研究，1)LDH异常电泳酶谱，m4h1m3h2m3h4() LD-5LD-4LD-3LD-2LD-1闪闪发光闪闪发光闪闪发光闪闪发光闪闪发光653 h和hm4h1m3h2m3h1LD4LD-5 LD-3 LD-1闪闪发光h1 m3h2h2h3hh2h3h3h3h 4，2 ) 核苷酸变异引起的氨基酸变化，2 )变异后的氨基酸的酸碱性和变异前的氨基酸的酸碱性不同，3 )变异的氨基酸位于分子的表面。结果：发生异常电泳结果；3 )异常谱形分析方法，LDH遗传变异和非遗传变异的分析流程图血清(浆)同工酶分析(异常形式)红细胞，白细胞同工酶分析正常谱型异常谱型免疫对流，固定，混合法鉴定遗传变异(h或m子变异) ()-) LDH-Ig复合物肿瘤致LDH基因分析、LDHH/m比率计算-LDH-1 LDH-2 LDH-3 LDH-4 LDH-5 h子基数43210M子基数01234 CDE- - -计算方法： h=a3/4b2/4c MDM=100-hh/m=h/(100-h )，2，后发性控制标记，1， DNA甲基化-后发性调控的主要方式是DNA甲基化不改变基因序列，通过向DNA的CG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子加入甲基来调节基因的表达。2 )启动子甲基化作为新的