荧光定量PCR详细流程和问题解析

荧光定量聚合酶链反应的详细流程及问题分析普通聚合酶链反应和荧光定量聚合酶链反应有什么区别？简单地说，聚合酶链反应技术首先被用于扩增特定的聚合酶链反应片段，用于克隆、测序和其他实验。后来，它还被用来确定样品中是否存在特定的聚合酶链反应片段，或者它是否相对粗糙。荧光定量聚合酶链反应技术用于确定样品中特定聚合酶链反应片段的相对和绝对量，是确定特定聚合酶链反应片段含量的一种方法。例如确定患者样品中病原体的含量和实验样品中特定的信使核糖核酸的含量。几年前，据说在普通的聚合酶链反应之后，也可以通过电泳进行定量。事实上，聚合酶链反应产物的定量与聚合酶链反应样品中模板的定量是混合在一起的。在过去的两年里，没有人再说过这样的话。如何选择赛博格林、塔克曼、分子信标和LUX？就实验成本而言，赛博格林是最好的。基本上，普通的聚合酶链反应加一点西布朗绿色荧光染料就足够了。它的信号强度也很好，并且还可以进行熔化曲线分析。然而，缺点是在一个反应管中只能检测到一个聚合酶链反应。另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果。当然，也有一些技术来解决这些问题，这将在后面讨论。对于研究人员来说，如果有许多基因需要检测，并且每个反应管中的聚合酶链反应检测能够满足实验要求，那么Sybr Green是最佳选择。如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行两个或多个反应，则应选择其他方法。最常见的方法是Taqman和分子信标，两者都是探针方法。由于探针的特异性增加，其扩增曲线反映了特定产物的扩增曲线，并且不包含非特异性扩增成分。因此，商业检测试剂盒大多采用这种技术来降低非特定产品导致错误结论的可能性。其缺点是探头成本相对较高，有时设计的探头不合适，可能造成损失。应该优化更多的实验条件。当用于商业目的时，两种探针技术都有专利问题。据说获得分子信标许可权的成本相对较低，但也只是说说而已。另一个值得一提的是LUX探针，它也可以进行多通道实验，但它不具备Taqman和分子信标方法增加探针特异性的功能，所以它只能是一个折衷的解决方案。如果不考虑多通道实验，它不如Sybr格林方法好。选择单通道实验还是多通道实验？这要根据实验的需要来选择。如果要比较一个、两个或三个基因，并使用管家基因进行比较，可以考虑多通道实验。多通道实验的优点是可以消除加样误差。然而，还有许多困难需要克服。一是条件的优化很麻烦，即多重聚合酶链反应和探针应该在相同的反应条件下高效地进行。另一个困难是相互之间不应该有干扰，因为干扰会影响实验结果。另一个困难是，当一个基因的模板数量明显大于其他基因时，由于共享诸如核苷酸等资源，模板数量较少的基因的数量值将变得更小或为零。因此，双通道实验更常见，即一个基因与多个样本进行比较，而管家基因用于比较。可以看出，如果单通道实验可以解决问题，不要选择多通道实验。当比较三个以上的基因时，最好使用一个通道。因为一般仪器最多只有四个通道，甚至更多的通道，实验条件的优化就够麻烦的了。如何克服双通道实验中反应条件、干扰和模板数差异大的困难？对于反应条件的优化，可以使用两个独立实验的标准曲线来优化，主要是复性温度。聚合酶链反应仪的温度梯度功能可用于选择并找到合适的复性温度。对于如何确定是否存在相互干扰，应该比较两个独立的单通道实验和双通道实验的结果。如果差别不大，那么就没有干扰。对于模板数量变化很大的问题，可以通过降低引物浓度来实现，即引物有限。在一般的聚合酶链反应中，引物的浓度高到足以基本上消耗反应溶液中的所有核苷酸。当优化引物浓度时，用不同的引物浓度进行实验，以找到不影响反应的C值的最低引物浓度。这样，在实际反应中，对于模板数高的基因，引物用尽后，反应液中仍有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。底漆设计中的几个注意事项1.考虑到引物自身折叠、错配、引物二聚体、复性温度、产物变性温度等问题，最好用相关软件设计引物。产品的变性温度不是很重要，但有些产品在95度的一般条件下不能完全解冻，这将严重影响实验结果。2.引物设计的片段必须具有足够的特异性。选择片段后，最好在互联网上搜索样本基因组中的相关基因和假基因。如果是，可以选择特异性较高的区域。3.当定量信使核糖核酸表达时，可以在引物设计中考虑基因组污染的问题，即在引物设计中两个引物跨越一个内含子，从而可以区分基因组污染引起的扩增，或者因为片段太大而不能进行扩增。4.由于mRNA表达的定量有一个反转录过程，如果用聚(T)作为反转录的引物，设计的片段应尽可能接近聚(A)，以免影响实验结果。如果用特异性引物进行反转录，应该考虑引物区是否存在核糖核酸二级结构的问题。5.产品片段的大小：定量聚合酶链反应通常产生不超过600个碱基的小片段。Sybr Green的方法一般选择250-600bp，太多会影响PCR扩增的效率，太少则难以通过熔解曲线从引物二聚体中分离出来，但不是绝对的。Taqman法的扩增片段非常小，几十个甚至超过100个，这是由其原理造成的。分子信标方法不需要太多的片段大小，只要它不太长。赛博格林方法的实验策略；实验可分为三个阶段，即实验条件的优化、预实验和正式实验。首先，实验条件的优化阶段，这一阶段是最耗时的，1.要找到阳性模板，可以克隆基因质粒、强阳性样品或纯化的聚合酶链反应产物。最基本的定量扩增实验只能用阳性模板进行。如果有正常的聚合酶链反应实验条件，也可以在此基础上进行实验。2.应通过电泳确定扩增产物的大小，以确认通过定量聚合酶链反应扩增的产物是您的目标基因。一些用户已经优化了几天的条件，才发现扩增的片段不是正确的大小，也不是他们想要的基因。当然，最好有一个序列或什么的。并通过熔融曲线实验来确定所产生的Tm值和所用的变性温度是否足够，在某些情况下会出现脱粘不充分的现象。3.基本聚合酶链反应条件满足后，阳性模板应稀释10倍。用阴性对照取稀释后的模板，分成几个部分进行温度梯度实验。优化复性温度，找出复性温度范围。复性温度最好满足以下条件：高、中、低模板浓度时，聚合酶链反应扩增效率高，阴性模板不扩增。选择符合条件的中间温度可以提高实验的稳定性，并且不影响实验结果4.如果找不到合适的条件，如引物二聚体太多，引物浓度、Mg2离子浓度、DMSO含量等。可以优化复性温度梯度实验。其中，Mg2离子浓度和DMSO含量都影响Tm值和变性温度。二、初步实验阶段根据优化后的条件，对待分析样品进行不重复实验，对每个样品进行10倍和100倍稀释实验。预实验有两个主要目的。一是了解样本的模板浓度范围。如果样品的模板浓度超出标准曲线，如果模板浓度过高或过低，标准曲线可能需要重新优化。当然，如果太高或太低不影响你的实验结论，它可以设置得更高或更低，直接外推是不科学的。另一个目的是观察样品中是否有聚合酶链反应抑制剂的作用。如果每个样品的定量结果与其10倍和100倍稀释样品的结果相同，则表明没有抑制剂的作用。如果不同，如原始结果为零，10倍和100倍稀释样品的结果为阳性，则表明样品中的聚合酶链反应抑制剂浓度高。可以用稀释10倍和100倍的样品对其进行定量。几个用户发现，在实验中呈阴性的样品在稀释10倍和100倍后呈阳性。也许更多的用户没有进行过这样的实验，得出了错误的结论。因为样品核糖核酸提取试剂通常含有抑制聚合酶链反应的物质，如果不清洗，定量聚合酶链反应将受到影响。三。正式实验阶段然后可以进行正式的实验，每个样本只需要重复三次或更多次。含有抑制剂的样品应首先稀释，在计算浓度时不要忘记稀释。最后，可以分析实验结果，并删除单个样本中的异常值。西布朗格林方法的注记1.最好按照上述策略进行实验，以避免不必要的重复实验，降低实验成本。2.Sybr Green I通常用二甲基亚砜将母液稀释100倍，最终浓度为4000-10000倍。不同Sybr Green母液的稀释比可能不同，这可以通过实验来证明，但高浓度的Sybr Green必然会影响聚合酶链反应。此外，用水稀释的Sybr Green I具有非常短的储存时间，通常在1周后不可用。二甲基亚砜似乎通过反复冷冻和解冻来影响性能，但原因不明。3.优化引物浓度、Mg2离子浓度和DMSO含量后，仍未获得满意的结果，特别是当引物二聚体较多时，可以考虑更换引物，因为引物成本低，优化实验成本高。4.当存在少量影响荧光结果的引物二聚体时，可以提高荧光阅读板的温度以消除引物二聚体的影响，例如，将阅读板的温度提高到82度，此时引物二聚体已经熔化，而产物没有熔化。但是，当引物二聚体的浓度很高时，会严重影响聚合酶链反应，消除引物二聚体的影响也是没有用的。5.众所周知，绝对量化需要标准曲线。有些用户认为相对定量不需要标准曲线，可以用2C(t)计算。然而，该仪器是有条件的，即所有荧光定量聚合酶链反应扩增的效率接近100%，这可以通过实验来证明。然而，大多数用户没有进行这样的实验，而是直接用2C(t)进行计算。这是错误的，会导致错误的结论。6.无论是使用自制试剂还是商用荧光定量试剂盒，最好购买足够的试剂，以避免在进行预实验或无试剂的正式实验时需要使用其他试剂。由于不同试剂的缓冲液组成差异较大，如某些试剂中含有的DMSO和Mg2离子，实验结果可能会受到影响，甚至可能需要再次进行实验条件的优化。7、不要在试管盖上写字，原因很明显，但有些用户习惯了写字，然后擦掉，也会对实验产生一些影响。8.最好使用高质量的聚合酶链反应试管。低质量试管的试管间差异10.当样品珍贵时，可以稀释样品进行定量。只要浓度不太低，理论上稀释不会影响实验结果。其他方法也可以采用类似的策略来节约成本和提高效率。这就是我的全部想法。我希望你能多批评我。反应体系的建立与优化资料来源：作者：发布日期：2008年10月17日1.SG浓度：最终浓度为133605，000-1:100，000，一般为1336010，000-1:70，0002.底漆浓度：最终浓度50纳米-300纳米固定触板浓度梯度实验没有触摸面板的对照实验(NTC)没有非特异性信号。熔化曲线分析是单峰的吗建议使用经高效液相色谱纯化的引物3.氯化镁浓度降低氯化镁浓度以减少非特定产品低至1.5纳米同时做梯度实验和NTC控制4.反应温度和时间参数反应温度是指所用酶的类型。退火温度由温度梯度函数优化反应时间与常规聚合酶链反应相似，扩增片段一般为200-300个碱基。5.TaqMan探针引物和探针设计：首先，选择探针序列探针的Tm值为68-70度，长度不应超过30个碱基。探针的5端不应是g，g可以淬灭荧光素。引物应尽可能靠近探针，扩增片段不应超过400bp，通常为80-150 bp。引物的Tm值为59-60度，长度约为20个碱基避免引物和探针之间的二级结构由综合公司委托设计使用辅助软件确定反应参数一般来说，这是一个94度10-20秒的两步过程。60度30-60秒(Taq酶在60度时具有最强的5核酸外切酶活性)利用温度梯度优化退火温度三步法，72度45秒引物探针浓度的优化目标：最高信号/背景比最小Ct值引物浓度：50纳米-900纳米探针浓度：50纳米-250纳米通过许多实验确定了各自的浓度和比例。从核糖核酸提取到聚合酶链反应的实时聚合酶链反应经验首先，底漆设计引物设计对于本实验非常重要，因为实时pcr具有很高的检测灵敏度，所以对引物设计的相应要求非常高。众所周知，还有其他几点必须注意：1.引物错配率(引物错配形成引物二聚体，但SYBR仍可嵌入，导致实验结果误差大、重复性差)。2.引物的特异性必须很高(与常规的聚合酶链反应不同，引物同源性不高，只要两种产物的片段长度足够不同，并且可以在电泳过程中被区分。实时聚合酶链反应只有在解链曲线时才能分离出来，因此整个实验误差较大，不可信)。3.引物被设计成跨越内含子，不能在一个外显子上扩增(我们的实验使用cDNA作为模板。如果有DNA污染，扩增就不能完成，因为DNA含有大分子量的内含子。这将大大有助于我们消除整个实验中的错误。4.引物设计应尽可能在相同的退火温度下进行，这样便于同时扩增许多不同的基因片段。然而，如果差异相对较大，就必须分开进行，浪费模板和管家基因。因此，各实验室应尽可能一致地设计引物，这样就不必每次都检查退火温度，这对整个实验是有利的。5.注意底漆设计后的产品长度。实时聚合酶链反应产品的最佳长度约为150-250kb(这本书说这可以提高荧光灵敏度并减少实验误差，但我对此说法持怀疑态度。产品长度越长，嵌入的SYBR越多，因此最终荧光值可以保证更加可靠)