序列分析软件DNAMAN_的使用方法中文ppt课件

序列分析软件DNAMAN的使用方法简介,饶志明博士/教授博士生导师江南大学生物工程学院工业微生物中心江南大学工业生物技术教育部重点实验室E-mail:raozhm,1,DNAMAN是一种常用的核酸序列分析软件。由于它功能强大，使用方便，已成为一种普遍使用的DNA序列分析工具。,2,打开DNAMAN，可以看到如下界面：,第一栏为主菜单栏。除了帮助菜单外，有十个常用主菜单，第二栏为工具栏：第三栏为浏览器栏：在浏览器栏下方的工作区左侧，可见Channel工具条，DNAMAN提供20个Channel，点击Channel工具条上相应的数字，即可击活相应的Channel。每个Channel可以装入一个序列。将要分析的序列（DNA序列或氨基酸序列）放入Channel中可以节约存取序列时间，加快分析速度。,3,4,如何使用DNAMAN分析序列,1将待分析序列装入Channel通过FileOpen命令打开待分析序列文件，则打开的序列自动装入默认Channel。通过Sequence/LoadSequence菜单的子菜单打开文件或将选定的部分序列装入Channel。通过Sequence/CurrentSequence/AnalysisDefination命令打开一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性质（DNA或蛋白质），名称，要分析的片段等参数。,5,2以不同形式显示序列,通过Sequence/DisplaySequence命令打开对话框，根据不同的需要，可以选择显示不同的序列转换形式。对话框选项说明如下：Sequence&Composition显示序列和成分,6,2以不同形式显示序列,ReverseComplementSequence显示待分析序列的反向互补序列ReverseSequence显示待分析序列的反向序列ComplementSequence显示待分析序列的互补序列DoubleStrandedSequence显示待分析序列的双链序列RNASequence显示待分析序列的对应RNA序列,7,3DNA序列的限制性酶切位点分析,将待分析的序列装入Channel，点击要分析的Channel，然后通过Restriction/Analysis命令打开对话框，参数说明如下：Results分析结果显示其中包括：Showsummary（显示概要）Showsitesonsequence（在结果中显示酶切位点）Drawrestrictionmap（显示限制性酶切图）Drawrestrictionpattern（显示限制性酶切模式图）,8,3DNA序列的限制性酶切位点分析,Ignoreenzymeswithmorethan（忽略大于某设定值的酶切位点）Ignoreenzymeswithlessthan（忽略小于某设定值的酶切位点）TargetDNA（目标DNA特性）Circular（环型DNA），dam/dcmmethylation（dam/dcm甲基化）allDNAinSequenceChannel（选择此项，在SequenceChannel中的所有序列将被分析，如果选择了Drawrestrictionpattern，那么当所有的channel中共有两条DNA时，则只能选择两个酶分析，如果共有三个以上DNA时，则只能用一个酶分析。）,9,选择所需的项目，然后按提示操作点击按扭，出现下列对话框：参数说明如下：Enzyme代表（enzymedatafile），点击旁边的下拉按钮，出现两个默认选项，restrict.enz和dnamane.enz，如果添加过自制的酶列表，则附加显示自制酶列表文件名。其中restrict.enz数据文件包含180种限制酶，dnamane.enz数据文件包含2524种限制酶。选择其中一个数据文件，相应的酶在左边的显示框中列出（按酶名称字母表顺序），鼠标双击酶名称，则对应的酶被选中，在右边空白框中列出。,10,要自制酶切列表，可以从左边酶列表中双击鼠标选择多种酶（例如puc18multiplecloningsites），然后点击按钮出现下列对话框：输入要保存酶列表的文件名，点击按钮即可保存。自制酶列表可以方便分析特定的酶切位点。Cutter酶切识别序列长度；End酶切产生的末端，其中包括，Blunt（平头末端），5Overhang（5突出粘性末端）,3Overhang(3突出粘性末端)，系统根据cutter和end的设定情况,在左边酶列表中显示符合条件的酶。最后，点击按钮执行操作。,11,4DNA序列比对分析（DotMatrixComparision）,要比较两个序列，可以使用DNAMAN提供的序列比对工具DotMatrixComparision（点矩阵比较）通过Sequense/Dotmatrixcomparision命令打开比对界面，点击对比界面左上角的按钮，出现下列对话框：,12,参数说明如下：,Sequencetype序列类型Sequence1参加比对的第一序列选择框，框内选项说明如下：如果要比对的序列在Channel中，点击下拉箭头，选择相应的Channel，则被选中的Channel中的序列作为参加比对的第一序列；也可以从文件夹中选择参加比对的序列，在File选择框上点击即可。通过Length选择参加比对的序列片段。Sequence2参加比对的第二序列选择框；选项说明同上ShowSequence选择此项，当同源性大于设定值时，将显示同源性；,13,Annotations是否显示注释Comparision比对参数，其中Window代表Windowsize（单位比对长度），Mismatch代表Mismatchsize（单位比对长度中许可的错配值）要快速比对，需将此项设为0。Bothstran代表Bothstrand（双链比对）选择此项，是指用Sequence2中的序列的正链和负链分别和Sequence1比较。Sequence2正链与Sequence1比较结果用黑色点表示，Sequence2负链比对结果用红色点表示。,14,Plotbox点阵图表显示参数，Position（起点坐标）Width（宽度值）Height（高度值）Framesize（边框线粗度值）Dotsize（点粗度值）Gridline（虚线框数）。参数设定好后，点击按钮执行操作。,15,5序列同源性分析,（1）两序列同源性分析通过Sequence/TwoSequenceAlignment命令打开对话框，如下所示：参数说明如下：Alignmentmethod比对方法，通常可选Quick(快速比对)或Smith&Waterman(最佳比对)，当选择快速比对时，设置较小的k-tuple值，可以提高精确度，当序列较长时，一般要设置较大的k-tuple值。k-tuple值可选范围26；蛋白质序列：k-tuple值可选范围13。,16,（2）多序列同源性分析,通过打开Sequence/MultipleSequenceAlignment命令打开对话框，参数说明如下：File从文件中选择参加比对的序列Folder从文件夹中选择参加比对的序列Channel从channel中选择参加比对的序列Dbase从数据库中选择参加比对的序列Remove清除选择的序列（鼠标点击左边显示框中的序列名选择）Clear清除全部序列,17,点击按钮，出现方法选择对话框：选择其中一种方法，点击按钮，出现下列对话框：如果在前一对话框选择的是Fastalignment,则在此对话框中选择Quickalignment,否则选择Dynamicalignment即可。其它参数不必改变，点击对话框中间的使其它参数取原始默认值。点击左上角按钮，可以从弹出的对话框中选择不同的结果显示特性选项。点击按钮下的按钮，出现下列选择项：可以通过这些选项，绘制同源关系图（例如Tree/homologytree命令）。显示蛋白质二级结构（ProteinSecondaryStructure命令），绘制限制性酶切图（RestrictionAnalysis命令）等。,18,6.PCR引物设计,首先，将目标DNA片段装入Channel,并激活Channel。点击主菜单栏中的Primer主菜单，出现下拉菜单，点击DesignPCRPrimersforDNA命令，出现下列对话框：参数说明如下：Primerlocationsontarget引物定位其中包括下列选项：Productsize（扩增目的片段大小）Senseprimer(正向引物选择区)Antisenseprimer(反向引物选择区)Primer引物特性包括Length(引物长度)，Tm值,GC含量等参数；Rejectprimer引物过滤（将符合引物过滤条件的引物过滤掉）,19,包括下列选项：3dimer(可形成3端自我互补的碱基数)Hairpinstem(可形成发卡颈环结构的碱基数)PolyN(多聚碱基)3Uique(3端严格配对碱基数)Allmatches(引物互补配对百分数)Consentrations浓度设定ProductforhybridyzatPCR产物用于SouthernBlot探针杂交,20,7画质粒模式图,我们常常要用到各种质粒图，无论是制作幻灯片，还是发表文章，常常需要质粒图。DNAMAN提供强大的绘质粒图功能，能满足我们的需要。通过Restriction/Drawmap命令打开质粒绘图界面：将鼠标移动到圆圈上，等鼠标变形成“I”时，单击鼠标左键，出现如下菜单：菜单说明如下：Position当前位置AddSite添加酶切位点AddElement添加要素AddText添加文字InsertFragment插入片断CopyFragment复制片断CutFragment剪切片断RemoveFragment清除片断FrameThickness边框线粗细调节,21,点击AddSite选项，出现对话框：参数说明如下：Name要添加的酶切位点的名称(例如HindIII)Position位置（以碱基数表示）点击AddElement选项，出现如下对话框：参数说明如下：Type要素类型（共有三种类型，鼠标点击即可切换）Color/Pattern填充色（共有16种颜色供选择）Name要素名称Start/End/Size要素起点/终点/粗细度,22,核酸序列的一般分析流程,23,1.1核酸序列的检索:80/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide1.2核酸序列的同源性分析1.2.1基于NCBI/Blast软件的核酸序列同源性分析/blast/blast.cgi1.2.2核酸序列的两两比较/gorf/bl2.html1.2.3核酸序列的批量联网同源性分析(方案),24,1.3核酸序列的电子延伸1.3.1利用UniGene数据库进行电子延伸(方案)1.3.2利用Tigem的ESTMachine进行电子延伸ESTExtractor:http:/gcg.tigem.it/blastextract/estextract.html|ESTAssembly:http:/www.tigem/ESTmachine.html1.3.3利用THC数据库对核酸序列进行电子延伸http:/gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.html,25,1.4核酸序列的开放阅读框架分析1.4.1基于NCBI/ORFfinder的ORF分析/gorf/gorf.html1.5基因的电子表达谱分析1.5.1利用UniGene数据库进行电子表达谱分析（方案）1.5.2利用Tigem的电子原位杂交服务器进行电子表达谱分析http:/gcg.tigem.it/INSITU/insitublast.html,26,1.6核酸序列的电子基因定位分析1.6.1利用STS数据库进行电子基因定位/genome/sts/epcr.cgi1.6.2利用UniGene数据库进行电子基因定位（方案）,27,1.7cDNA的基因组序列分析1.7.1通过从NCBI查询部分基因组数据库进行基因组序列的分析(方案)1.7.2通过从NCBI查询全部基因组数据库进行基因组序列的分析/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&ORG=Hs1.7.3通过从SangerCentre查询基因组数据库进行基因组序列的分析http:/www.sanger.ac.uk/HGP/blast_server.shtml,28,1.8基因组序列的初步分析1.8.1基因组序列的内含子/外显子分析/urllists/genefind.htm1.8.2基因组序列的启动子分析/projects/promoter.html,29,1.9核酸序列的注册1.9.1EST序列的注册(方案)1.9.2较长或全长cDNA序列的注册(方案)1.10待分析序列所对应的已知克隆的获取,30,引物设计,引物引物的重要性引物设计的原则引物与PCR引物设计软件如何使用PrimerPremier5.0引物同源性分析,31,引物（primers),引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。,3,3,5,5,Senseprimer,Antisenseprimer,32,引物的重要性,在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。,33,引物设计原则,引物长度碱基分布的均衡性Tm值引物二级结构引物3端引物5端引物的内部稳定性引物的保守性与特异性扩增区域的二级结构,34,引物长度,一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。,35,碱基分布的均衡性,同一碱基连续出现不应超过5个GC含量一般40-60%GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性GC含量太高也易于引发非特异扩增。,36,引物Tm值,一般要求：55-65。计算：对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。Tm=H/(S+R*ln(C/4)+16.6log(K+/(1+0.7K+)-273.15,37,引物二级结构,引物二聚体尽可能避免两个引物分子之间3端有有较多碱基互补发夹结构尤其是要避免引物3端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。,38,引物3端,引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。,39,引物5端,引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。,40,引物的内部稳定性,过去认为，引物3端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3端最好为G或C。现在的观点认为，引物的5端应是相对稳定结构，而3端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3端尽可能选用A或T，少用G或C。仅仅3端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。如果3端为富含G、C的结构，只需3端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。,41,引物的保守性与特异性,保守性：通用引物检测同一类病原微生物尽可能多的型别特异性：避免非特异性扩增,42,扩增区域的二级结构,模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。扩增区域的自由能（G。）小于58.61kJ/mol引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30Tmproduct=81.5+16.6log(K+/(1+0.7K+)+0.41(%G+%C)-500/length,43,引物与PCR,引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L引物浓度(uM)=nOD33/（A312C288G328T303-61）/VH2OVH2O(单位：L)退火温度最适退火温度（TaOpt）=0.3(Tmofprimer)+0.7(Tmofproduct)25一般