ELISA相关问题及对策修改版.ppt

ELISA试验方法的相关问题及质量控制,河北医科大学第二医院检验科李永军,酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)1971年由瑞典学者Engrall和Perlmann,荷兰学者Vanweeman和Schuurs报道。开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质测定的实验方法。,酶免疫技术的分类酶免疫组化酶免疫技术均相酶免疫测定酶免疫测定液相酶免疫测定异相酶免疫测定固相酶免疫测定（ELISA）,Ag+Ab*AgAb*+Ab*均相法：抗原抗体反应后AgAb*中的标记物失去特性，不需进行AgAb*与Ab*的分离，可直接测定游离的Ab*量，从而推算标本中的Ag量。异相法：抗原抗体反应后，需将AgAb*与Ab*，然后测定AgAb*或Ab*的量，从而推算标本中的Ag量。,ELISA方法的基本原理（1）使抗原或抗体结合到固相载体表面，并保持其免疫活性。（2）使抗原或抗体与酶结合成酶标抗原或抗体，并保持抗原或抗体的免疫活性和酶的活性。（3）酶标的抗原或抗体与相应的抗体或抗原反应后，结合在免疫复合物上的酶催化底物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，其颜色的深浅与标本中的抗原或抗体的量直接相关。,ELISA方法的基本类型（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法,（一）双抗体夹心法,洗涤,洗涤,洗涤,待测抗原,（二）间接法,洗涤,洗涤,洗涤,待测抗体,酶标抗抗体,（三）竞争法,洗涤,洗涤,待测抗原,酶标抗原,双位点夹心法,捕获法,固相抗IgM,特异IgM,非特异IgM,标本,特异抗原,抗原特异酶标抗体,底物,ELISA试验的方法学原理,一步法：Ab+Ag+Ab*AbAgAb*(a)AbAg(b)AgAb*(c)Ab*-AgAb(d),二步法AbAg+Ab*AbAgAb*Ab*+AgAb*Ag(洗涤),ELISA方法的影响因素及控制,表面效应(Surfaceeffects)蛋白质分子在吸附过程中，为了克服与固相载体之间的排斥力需要重新分布其表面的功能性基团，使疏水性基团充分暴露，然后局部接触区域的偶极分子脱氢，再通过范德华引力而固相到载体表面。表面效应可直接影响抗原、抗体的够象和功能,固相导致抗原的变化为了测定抗体的水平，需预先将抗原（包被）到极性和疏水性的聚苯乙烯（PS）或聚氯乙烯（PVC）微板上，利用直接物理吸附方法固相蛋白质抗原，可引起分子够象和抗原性发生改变,固相对抗体的影响将抗体固相化时，直接吸附法固相抗体分子，除了呈团串状，不均匀分布，易解吸等外，还可发生构象改变，使抗体结合价减少甚至失活。,高剂量钩镰效应(HD-HookEffects)发生在固相法试验过程中的，可造成假低值甚至假阴性错误结果的特殊效应，称为HD-Hook效应。,边缘效应(Edgeeffects)由于微量反应板周边孔与内部孔升降温速率的差别，造成周边孔与内部孔结果的差异，这就是边缘效应或位置效应,弥散效应(Diffusionlimits)在固相法中抗原抗体结合，底物与酶的接触，转换的信号产物向液体内弥散的过程中，液相与固相中的分子必须穿过液面的Nernst层，也就是液固屏障，使反应速率受到限制。,干扰物质类风湿因子补体嗜异性抗体血清粘度过大、血脂过高胆红素、血红蛋白抗凝剂（肝素、EDTA）酶类,类风湿因子,类人血清中IgM、IgG型风湿因子可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，导致假阳性。将热变性IgG（63，10分钟）加入到标本稀释液中。用2-巯基乙醇加入到标本稀释液中，使RF降解。,补体,在固相化和标记抗体的过程中，抗体FC段的补体C1q分子结合位点被暴露，使C1q可以将二者连接起来，造成假阳性。用EDTA稀释标本。用63，10分钟或56，30分钟加热使C1q灭活。,嗜异性抗体,人类血清中含有能与齿齿类动物（鼠）Ig结合的天然嗜异性抗体，可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来，造成假阳性。在标本稀释液中加入过量的动物Ig。,标本溶血,标本溶血可使红细胞破坏溶解释放出大量的具有过氧化物酶活性的血红蛋白，从而导致非特异性显色。,标本受细菌污染,菌体中含有内源性辣根过氧化物酶，被细菌污染的标本，在以辣根过氧化物酶为标记物的ELISA测定中，会导致非特异性显色。,标本保存不当,在冰箱中保存过久的标本，血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体，在间接法ELISA测定中会造成假阳性。标本放置时间过长，有时抗原或抗体的免疫活性减弱，亦可出现假阴性。5天内测定的血清标本可存放4，1周后测定的血清标本应低温冻存。,标本凝集不全,在没有促凝剂和抗凝剂的情况下，正常血液采集后1/22小时开始凝固，1824小时完全凝固。强行分离血清，血清中会有纤维蛋白原残留，形成假阳性。充分凝固后分离血清；用带分离胶的采血管或采血管中加入抗凝剂。,添加物质的影响,抗凝剂（如肝素，EDTA）、酶抑制剂（如NaN3)、分离胶等可干扰ELISA测定。,ELISA试验的有关问题,洗涤液洗涤的目的：除去未结合的免疫反应物；终止抗原抗体的继续结合；除去血清中与反应无关的其它成份和游离的酶结合物；以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。,洗涤液的种类：蒸馏水吐温-蒸馏水吐温-生理盐水PBS-吐温-蒸馏水Tris-吐温-蒸馏水（PH均为7.2或7.4）,Tween20月桂酸（液体）Tween40棕榈酸（液体）Tween60硬脂酸（固体）Tween80油酸（液体）,阈值(Cutoff值，阴阳界值)进行大量阴性标本OD值的检测，统计阴性标本的平均值和标准差。以X+SD为界值，一个标本值小于此界值时，是阴性的可能性为68%。以X+2SD为界值，一个标本值小于此界值时，是阴性的可能性为95%。以X+3SD为界值，一个标本值小于此界值时，是阴性的可能性为99%。,为什么阴性标本会略显色而不是完全无色呢？由于目前分离、纯化、检测技术等方面的限制，基因工程抗原和合成多肽都不可能达到100%纯度，往往含有2-5%的杂蛋白。同时ELISA反应板的非特异性吸附也不可避免。,阳性标本不显色,（2）基因工程抗原和合成多肽抗原的差别,ELISA试验的影响因素及对策,灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示检测下限的能力。相对灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）*100%1）试剂盒（运输时间太长、温度太高）2）试剂、样品用前要平衡3）试剂开启时间长、长菌4）吸液器吸量不足5）恒温箱不足37或温育时间不足6）洗涤方式不对7）显色剂加量不足8）显色反应时间不足,重复性：对同一样品重复分析的结果间的符合性变异系数CV=SD/X*100%,1）样品加入后未混匀2）移液器加样量不一致3）洗涤方式不正确4）唾液或其它杂质掉入孔内5）酶或显色剂B加量不一致6）标本处理不当7）酶标仪测定重复性差8）保温时间及显色时间不一致9）阈值附近的标本,特异性：对阴性标本给出阴性结果的能力相对特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）*100%,1）配制洗液的蒸馏水污染2）酶加量过多3）洗涤不充分，样品中其他成分残留或有酶残留4）显色剂暴露时间太长5）恒温箱温度失控6）加酶或显色剂后反应时间过长7）吸头重复使用,室内质量控制,分析批：是一个区间（一段时间或测量样本量)预期在此区间内检测系统的准确度和精密度是稳定的。分析批长度厂家推荐的批长度用户规定的批长度,质控品每一分析项目在用户规定的分析批长度内必须检测质控品。质控品的成分应与检测患者样本的基质一样或相似。质控品应均一、稳定，瓶间变异性要小于分析系统的变异。质控品不能作为校准品使用。质控品可以自制也可购买成品。,ELISA测定每块板都要测定室内质控品。定性测定可采用弱阳性质控品的s/co值作质控图。定量测定参照临床化学的绘制方法。凝集试验的室内质控品可采用试剂盒所带的阴阳性对照。,ELISA检测室内质量控制的方法,定值标准质控物随机阳性质控物自配定值质控物,将某一质控物连续测定20天，测算出其均值、标准差。2SD为警戒值；3SD为失控。,定值标准质控