弧菌和弯曲菌.ppt

弧菌和弯曲菌，医学检验系临床微生物和免疫学教室井申荣，第一部分弧菌，概述，弧菌科(Vibrionaseae )包括氧化酶阳性、极端鞭毛、动力阳性的细菌群，共4个菌属。 其中弧菌属为氧化酶阳性、发酵葡萄糖、弧菌抑制剂O/129 (二氨基二异丙基)敏感细菌。 弧菌属(Vibrio )广泛分布于自然界，水尤其多，有100多种。 主要病原菌为霍乱弧菌和肠炎弧菌(致病性嗜盐菌)。 前者能引起霍乱；后者能引起食物中毒。 霍乱弧菌、霍乱弧菌(V.cholera )是人类霍乱的病原体，霍乱是古老流行的暴发传染病之一。 曾多次在世界上引起大流行，主要表现为剧烈呕吐、腹泻、脱水，死亡率非常高。 属于国际检疫的强烈传染病。 霍乱弧菌有古典生物型(classbiotide )和埃尔特生物型(EL-Torbio-type )两种生物型。 这两种类型除了个别生物学性状略有不同外，形态和免疫学性质基本相同，临床病理和流行病学特征无本质差异。 1817年以来，全球发生了7次全球流行。 前6次病原体为古典型霍乱弧菌，第7次病原体为埃尔特型。 1992年10月在印度东南部发现了引起霍乱流行的新血清型菌株(0139 )，其引起的霍乱在临床表现和传播方式上与古典型霍乱完全相同，但未诊断为01组霍乱菌中凝集血清。 该菌株在水中的生存时间长于01组霍乱弧菌，有可能成为引起全球霍乱流行的新菌株。 另一方面，生物学性状(一)的形态染色，霍乱弧菌呈弧或逗号形态，大小为1.42.60.50.8m。 革兰阴性菌，菌体一端有鞭毛和菌毛，无荚膜和芽孢。 将霍乱患者的米泗水样粪便作为活菌悬滴观察，细菌运动极为活跃，呈流星梭运动。 图注：霍乱弧菌鞭毛()及其可溶解鞘膜()为负染，3100，图注：分裂中霍乱弧菌冻蚀，70000，(2)培养特性，霍乱弧菌为好氧性或两性厌氧菌，营养要求不高，耐碱不耐酸，ph为pH8.89.0 由于其他细菌难以在pH值下生长，碱性胨水可作为选择性繁殖霍乱弧菌的培养基，碱性平板上菌落的直径为2mm、圆形、光滑、透明。 常用的选择培养基为硫代硫酸盐柠檬酸盐蔗糖琼脂平板(TCBS )，霍乱菌在其中形成大菌落，通过蔗糖发酵产酸，菌落变黄。(三)生化反应表明，两种生物型霍乱弧菌分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，产酸不产生产气剂。 慢发酵乳糖不分解阿拉伯糖。 氧化酶、明胶酶试验均为阳性。 靛蓝基质、霍乱红反应阳性、ElTor型霍乱弧菌与古典型霍乱弧菌的生化反应不同，ElTor型V-P试验阳性，产生强溶血素，溶解羊红细胞，血平板上生长的菌落周围出现明显的透明溶血环，古典型试验V-P试验阴性，不溶解羊红细胞。 单个ELTor型霍乱菌株也不溶血。 (4)抗原性1 .抗原结构：2 .组和分类：o抗原特异性可将霍乱弧菌分为139个血清组。 根据是否与O1组抗血清凝集，O1组抗血清凝集的称为O1组霍乱弧菌的O1组中未抗血清凝集的其他血清组统称为O1组以外的霍乱弧菌。 血清型： O1组霍乱弧菌菌体抗原由a、b、c三种抗原成分组成，生物型： O1组霍乱弧菌有古典生物型和E1Tor生物型的区别，两种生物型具有相同的血清型。 我国流行ElTor、小河型霍乱弧菌。 噬菌体分型：分型噬菌体的敏感性，其中比较实用的是第iv组和第v组的噬菌体。90%以上为阳性-90%以上为阴性d10-89%阳性，(5)变异性： (6)抵抗力、霍乱弧菌的古典生物型对外环境抵抗力弱，EL-Tor生物型抵抗力强。 霍乱弧菌对热、干、日光、化学消毒剂和酸敏感，低温、耐碱，不耐酸。 霍乱弧菌对链霉素、氯霉素和四环素敏感，但ElTor生物型对一定浓度的聚合酶b和庆大霉素有耐药性。 二、致病性和免疫性1 .致病物质，(1)鞭毛、菌毛、黏液酶(2)霍乱肠毒素(choleraenterotoxin )霍乱肠毒素本质上是蛋白质，缺乏耐热性。 对蛋白酶敏感，抵抗胰蛋白酶。 这种毒素是外毒素，具有很强的抗原性。 致病机制，对霍乱菌、胃、酸敏感，即刻被杀死，肠、胃酸下降或缺乏，菌体增多，大量繁殖于鞭毛、菌毛、粘液酶、绒毛，CT的b亚基与神经节苷受体结合形成膜通路，A1肽链进入细胞，ATPcAMP、 肠黏膜上皮细胞分泌亢进，肠液大量分泌，大量体液和电解质进入肠腔发生剧烈呕吐，大量脱水和盐丧失，发生代谢性酸中毒、血液循环衰竭、休克和死亡，激活腺苷酸环化酶系统，2 .引起疾病，引起严重肠道感染的霍乱， 我国法定传染病(甲类)表现为严重腹泻，可导致严重脱水、酸中毒、抽搐、尿潴留、休克和死亡。 人是大自然中霍乱弧菌的唯一感受者，主要通过受污染的水源和饮食物由口传播。 患者出现上吐下泻，腹泻呈“米泗水样”，含有大量弧菌，是本病的典型特点。 免疫性，患霍乱的人能获得坚固的免疫力，感染者很少。 病后小肠内出现分泌型lgA。 三、微生物学诊断由于霍乱流行快，流行期间发病率和死亡率高，危害极大，早期及时准确诊断对本病蔓延的治疗和预防具有重要意义。 (1)取样：取样以粪便为主，一般米泗水样品取1-3ml，成型取蚕豆大小。 有时，呕吐物和尸体肠的内容物也可用作检查材料。 检查程序为： (3)检查方法和鉴定1 .直接镜检：1 )动力观察：取患者“米泗水样”大便或呕吐物制作悬滴片，观察细菌动力，观察流星或梭状动力细菌。 2 )制动试验：标本，霍乱多价诊断血清(有效价值1:64 )，用暗视镜观察，3分钟内运动受到抑制是阳性的，该方法的优点是快速、特异性操作简便，但必须检测出大量的弧菌。 3 )涂抹染色：革兰氏染色阴性，鱼群状排列的弧菌。 2 .快速诊断：1 )免疫荧光菌球法：将标本接种到含有霍乱弧菌荧光抗体的碱性蛋白胨水中，在37下接种46小时，如果有霍乱弧菌，则用荧光显微镜观察荧光菌球。 本法适用于制作大量标本的初筛。 2)SPA协同凝集试验：以霍乱弧菌IgG型抗体与SPA阳性葡萄球菌结合为试剂，与美泗水样便或增菌液玻璃片凝集，即出现明显凝集者()。 3、细菌分离培养1 )直接分离培养：分离用培养基有强、弱2种选择培养基。 弱选择培养基：碱性琼脂和碱性胆盐琼脂。 强烈选择培养基：常用庆大霉素琼脂、4号琼脂和TCBS琼脂等。 目前多采用碱性胨水增菌，用强选择培养基分离。 4 .鉴定：根据霍乱菌在各种选择培养基上的特点，选择可疑菌落进行鉴定。 鉴定以血清学(玻璃片凝集)为主，结合形态学、生化反应进行判断。 1 )玻璃片凝集试验：从分离培养基中采集霍乱弧菌的多价诊断血清，进行玻璃片凝集试验。 将血清稀释至1:32-1:64效价后使用，立即诊断凝集者阳性，将生理盐水与阳性细菌株进行对照。2 )形态学检查：取纯培养物革兰氏染色，观察菌体形态和染色性。 用悬滴法或半固体穿刺法检测动力。 3 )生化反应：霍乱弧菌氧化酶试验、靛蓝基质试验、粘胶试验和霍乱红试验均阳性。 粘胶试验：测定霍乱弧菌形成粘胶的特性。 将0.5%脱氧胆酸钠水溶液混入霍乱菌中制成浓厚的菌液，在1min以内悬浊液混变粘稠，用接种环采集时可引线。 霍乱弧菌的古典生物型和ElTor生物型均为阳性。 霍乱红试验：出现玫瑰色，霍乱红试验阳性。 霍乱弧菌和其他弧菌均有此反应，因此无特异性。 (由于霍乱弧菌分解色氨酸产生吲哚，霍乱弧菌液可将硝酸盐还原成亚硝酸盐，所以当霍乱弧菌在含有硝酸盐成分的胨水中培养时，产生的亚硝酸盐与吲哚和亚硝酸吲哚结合，滴加浓硫酸后出现玫瑰色，称为霍乱红试验阳性129敏感试验：将o/129 (2，4 -二氨基- 6，7 -二异丙基)药敏纸片(10-150g )贴在测定对象的琼脂平板上进行纸片扩散试验，4 )霍乱弧菌的分型鉴别试验：血清分型：以小川型和稻叶型单价诊断血清为玻璃片凝集。 与小川型血清凝集，与稻叶型血清不凝集者为小川型，相反为稻叶型。 两单价血清均明显凝集者为彦岛型。 生物型别鉴定：目前两型主要通过第组霍乱噬菌体分解试验鉴定，并辅助多黏菌敏感试验、鸡红细胞凝集试验、V-P试验和溶血试验。 第iv组霍乱噬菌体降解试验：第iv组霍乱噬菌体常规稀释液(106/ml )一般只降解经典型，ElTor型不降解。 多粘菌b敏感性试验：将被检菌2-3h肉汤培养物点种在含药营养琼脂平板上(多粘菌B50U/ml )，37培养24小时，ElTor生物型生长，古典型敏感。可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可可使用可可可可可可可可可使用的可可可可可可可可使用的可可可可可可使用的可可可可可可使用的可可可鉴定要点：诊断O1组霍乱弧菌的必要条件： 1、涂膜选择革兰阴性弧菌或杆菌2、TCBS等培养基典型菌落特征3、动力阳性4、O1组霍乱弧菌诊断血清凝集试验阳性。 四、预防原则，必须贯彻预防。 人群疫苗的预防接种取得了良好的效果，治疗主要是液体和电解质的补充和抗菌药物，如四环素、链霉素、氯霉素、氧霉素和氟哌啶类抗生素的使用。 第二部分弯曲菌属、弯曲菌属(Campylobacter )细菌是一种微氧、不分解的糖类、氧化酶阳性、菌体弯曲为逗号状、s型或螺旋状、有动力的革兰氏阴性菌。 致病于人类的主要是空肠弯曲菌和胎儿弯曲菌胎儿亚种，前者是人类腹泻最常见的病原菌之一，后者免疫功能下降可引起败血症、脑膜炎等。 本节主要介绍空肠弯曲菌本属的生物学特性和检测方法，一是生物学性状，(一)形态与染色空肠弯曲菌(C.jejuni )菌体轻度弯曲呈逗号状，长1.55m，宽0.20.8m。 菌体一端或两端有鞭毛，运动活跃，暗视镜观察为苍蝇。 有荚膜而不能芽胞。 革兰氏阴性。图注：空肠弯曲菌两端鞭毛()为负染，21000、(二)培养特性为微好氧菌，在含氧2.55%和co210%的环境下生长最好。 最佳温度为3742。 在正常的大气或无氧环境下不能成长。 本菌营养要求高，不加血清不能生长。在凝血血清和血琼脂培养基中培养36，可见无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落中心隆起，周围不规则，无溶血现象。 (3)生化反应空肠弯曲生化反应惰性，糖类不发酵，尿素不分解，明胶不液化，靛蓝基质阴性。 硝酸盐可还原，氧化酶和过氧化氢酶阳性。 甲基红与VP试验阴性； 枸楠酸盐培养基上不生长。 (四)抵抗力不强，易干燥，易被直射阳光或弱消毒剂杀死，565分钟杀死。 对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素很敏感。 但是，近年来发现了很多耐药菌株。 (5)抗原结构本菌抗原结构与肠道杆菌一样具有o、h、k抗原。 o抗原可将空肠弯曲菌分为45个以上血清型。 二、致病性和免疫性，空肠弯曲菌是多种动物，如牛、羊、犬和鸟类的正常寄居菌。 污染食物和饮水可能引起人类急性肠炎和食物中毒，其原因与肠毒素、内毒素、细胞毒素、侵袭力有关。 感染后可产生特异性血清抗体，三、微生物学诊断，(一)取样：取腹泻患者新鲜粪便及肛拭子立即检查。 如果不能马上检查的话，必须把样本接种到卡片-布输送培养基中。 (2)检查程序： (3)检查方法及鉴定1 .直接涂膜(1)悬滴标本检查：在显微镜下观察有无飞镖式或螺旋状运动的细菌。 脑脊液做涂膜做悬滴检查。 (2)革兰氏染色检查：革兰氏阴性、逗号状、s形或螺旋状小杆菌。2 .分离培养：选择培养基分离接种到高度选择性的平板培养(泡沫血