马铃薯茎尖剥离与试管苗培养技术

马铃薯茎尖剥离与试管苗培养技术摘要：在无菌环境下对马铃薯茎尖进行剥离，并分步接种到特定的培养基上，在25 2 的温度、1 000lx4 000lx的光照条件下培养，并经病毒鉴定后可生产出健康的马铃薯脱毒试管苗。对试管苗进一步切段繁殖，可生产大量的脱毒苗。关键词：马铃薯；茎尖脱毒；试管苗；培养技术马铃薯在种植过程中易感染病毒，当条件适合时，就会在植株体内增殖、转运和积累于所结的薯块中，并且世代传递，逐年加重。造成植株生长势明显变差，块茎变小，产量不断下降，品质逐年变劣，食用性和商品性受到严重影响，品种失去了原有的优良种性，这就是马铃薯的退化现象。马铃薯病毒的增殖与植株正常代谢极为密切，目前尚未发现既能杀死病毒又不损伤植株的药剂，因此，病毒危害一度成为马铃薯的不治之症。茎尖组织培养无病毒植株技术的迅速发展，为解决马铃薯病毒危害提供了有效途径。利用组织培养技术生产健康无病毒种薯，成为目前生产中解决马铃薯退化最先进的技术措施之一。 在马铃薯植株体内，病毒的分布极不均匀，其中茎尖部分带病毒最少或不带病毒，并且越靠近尖端，病毒浓度越低。根据这一特性，在无菌条件下借助解剖镜剥离茎尖分生组织，并接种到装有特定培养基的试管（或三角瓶）内进行培养，经病毒鉴定后可获得脱毒小苗。对脱毒苗进一步切段繁殖，当达到所需数量时，通过基质栽培可生产大量的脱毒种薯。种植经过脱毒的种薯，其产量、质量以及抗逆性都有很大程度的提高，因此，组织培养技术成为提高马铃薯生产力的一个重要手段。下面将马铃薯茎尖剥离与试管苗培养技术介绍如下：1茎尖剥离1.1 材料的选取与消毒1.2 供培养用的茎尖最好取自活跃生长的芽，顶芽的茎尖生长要比腋芽的快，成活率也高。材料的选取。最好是在马铃薯生长季节选择具有原品种特征特性的单株，收获后对入选的块茎用0.501mg/kg的赤霉素浸种20min，然后置于温室内的砂床上或种在无菌的盆土中育芽。管理中应注意浇水时要直接浇在土壤中，切忌浇在叶片上，以防止水分感染茎尖。对于田间种植的材料还可以切取插条在实验室的营养液中培养，由这些插条的腋芽长成的枝条，要比从田间植株上直接取来的枝条污染少得多。如果直接从田间取材，在切取外植体前要将顶芽或侧芽连同部分叶柄和茎段一起在2%10%的次氯酸钠溶液中浸泡1015min。对上述培养的材料待芽长到5cm时剪取芽尖约23cm，用镊子剥去易见的叶片后等待消毒。1.3 消毒时先将剥取的材料用纱布包好，并置于自来水下冲洗30min左右，然后在无菌室内用0.10%0.20%的氯化汞溶液浸泡810min，再用70%的酒精消毒1020s，最后用无菌水冲洗35次，并用消毒后的滤纸吸干材料表面的水分。消毒是否彻底，是能否得到脱毒苗的关键环节，因此，一定要按照要求严把消毒质量关，并且操作要谨慎小心，避免损伤组织。1.4 1.2茎尖剥离与接种1.5 茎尖剥离与接种要求无菌操作，故做好接种室的消毒是至关重要的。接种室的污染来源主要是空气中的细菌和真菌孢子，因此，接种前应进行地面的清洁卫生工作，并用70%酒精喷雾降尘，同时用紫外灯照射20min，以减少空气中的病菌，提高接种质量。1.6 剥离茎尖一般在超净工作台上进行，需要一解剖镜（840）、解剖针、镊子和刀片等。解剖前首先将手和所用工具、超净工作台面等用70%的酒精或新洁尔灭彻底清擦一遍。1.7 第一步：解剖。解剖是在双筒解剖镜下进行的，左手拿镊子固定材料，右手同时拿解剖针层层剥掉幼叶，直至露出带两个叶原基的生长点时，切下只带一个小叶原基的茎尖，并迅速接种到经过高压灭菌的MS固体培养基上。每瓶接种1个茎尖。为防止交叉感染，解剖刀、解剖针和镊子等接种工具使用一次后应放入70%酒精中浸泡，然后灼烧放凉备用。1.8 第二步：接种。左手拿试管或三角瓶，用右手轻轻取下包头纸，以免纸上的尘土飞扬，造成污染。将试管或三角瓶口靠近酒精灯火焰，瓶口要倾斜，以免空气中的微生物落入瓶中。同时将瓶口外部在灯焰上燎数秒钟，然后用右手的小指和无名指配合手掌面慢慢取出棉塞（注意取塞动作要慢，以免气流冲入瓶中造成污染），再将瓶口置灯焰上旋转灼烧，然后用镊子将外植体插入试管或三角瓶内的培养基中。接种完成后立即用纱布棉球塞紧瓶口（塞前将棉球在火焰上旋转灼烧数秒钟），并用锡箔纸或牛皮纸包裹，用线绳或橡皮筋扎紧，作好标记，注明材料名称和接种日期。1.9 外植体解剖时必须注意使茎尖暴露的时间越短越好，并在材料下垫一块湿润的无菌滤纸以保持茎尖的新鲜。同时动作要轻微，以免损伤组织。1.10 马铃薯茎尖无毒区约0.100.30mm，但各种病毒之间存在差异，因此剥离的茎尖大小与茎尖所带病毒的数量有很大关系。茎尖越小，所带病毒越少；茎尖越大，所带病毒越多。但若剥离的茎尖太小，就会降低成活率。故剥离时要根据实际情况选择茎尖的大小。1.11 为减少接种污染，工作人员使用的工作服、帽子、口罩等，要经常保持干净，并定期进行消毒，即将洗净、晾干的衣帽、口罩等装在纸袋内与培养基一起进行高压灭菌。工作人员的头发、衣服、手指中都有许多杂菌，为此接种时一定要穿上工作服，戴上帽子，也必须剪除指甲，并用肥皂清洗，最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10min，接种前则用70%酒精擦洗。工作人员的呼吸所产生的污染，主要是在接种时谈话或咳嗽所引起的，因此，操作时应禁止谈话并戴上口罩。1.12 MS培养基成分主要有大量元素、微量元素、有机成分、植物生长调节剂、蔗糖、铁盐和琼脂。用于最初植入茎尖组织的培养基，除大量元素减半外，每升培养基另加1mlIAA、1mgKT和0.50mg2.4-D。1.13 2基础苗的培养1.14 接种好的试管或三角瓶置于培养室内培养。马铃薯茎尖培养需要的最适光照强度随发育时期应逐渐增加，培养最初的最适光照强度是1 000lx，4周后要增至2 000lx，当茎尖长到1cm高，大约56周后光照应加至4 000lx。光照时间1620h，室内光源以日光灯为主，但尽量采用自然光照效果会更好。1.15 马铃薯茎尖培养对温度没有特殊要求，但温度过高或过低对茎尖生长发育不利，一般在标准室温（252 ）中培养即可。1.16 当茎尖组织泛绿后转接到每升加0.50mg2.4-D和1mgZT的半量MS培养基中进一步培养。待愈伤组织增殖和多芽原基形成后，再转接到无激素的半量MS培养基上培养，34个月即可长成35片叶子的小苗。1.17 3病毒鉴定1.18 对通过茎尖剥离培养的小苗切段繁殖数瓶后，每株的后代留一部分保存，另一部分进行病毒鉴定。鉴定方法有植株直接测定法、指示植物测定法、血清学方法和电镜法。但血清法灵敏度高，获得检测结果迅速，是目前检测病毒的一种最好方法。用血清法检测后凡呈现阳性反应者全部淘汰，对阴性反应的植株再进行指示植物鉴定。经指示植物鉴定不带病毒的脱毒苗即可供以后扩大繁殖。1.19 4脱毒苗的扩大繁殖1.20 把经鉴定不带主要病毒的脱毒苗拿到接种室内进行检验整理，凡有污染者全部淘汰。将健康的无毒苗按品种归类编号，以备繁殖。并准备足够的150ml的三角瓶（或广口瓶）和其它用具，如纱布、棉球、锡箔、牛皮纸、橡皮筋、手术剪、培养皿、酒精灯等消毒后放入接种室。把事先配制好的、不加任何生长调节剂的MS培养基，按30ml左右的标准装入瓶内，并经高压灭菌后备用。1.21 切段繁殖无毒苗仍在接种室的超净工作台上进行，先将无毒苗从瓶内剪断取出，在培养皿内再剪成只带一个叶子的茎段，均匀平放或扦插到培养基上，每瓶510个，接好后用棉塞塞紧瓶口，并用牛皮纸或锡箔纸包扎后送入培养室进行培养。具体操作基本同1.2节“茎尖剥离与接种”。1.22 在切段繁殖的过程中若采用以下方法，可有效地提高繁殖速度：一是在剪取瓶内小苗时，若在小苗基部留一片叶子，其叶腋处又可生长出一株小苗，即切接后留根。其长势和生长速度不亚于新植小苗（采用此法，瓶内培养基应增加1/3或留根后加入一定量的液体培养基）；二是将剪取的茎段扦插到培养基上,在相同的培养条件下，可比平放的成苗时间提前710d。1.23 为了促进小苗快速生长，培养室温度可增至2528 ，在1 0001 500lx的光照条件下连续照射，一周左右叶腋间即可长出新芽，以后逐渐增加光照，约25d左右即可长成35片叶子的小植株，便可再次进行切段繁殖，直至达到所需数量。1.24 最后一次繁殖的试管苗因要进行栽植，为了提高移栽成活率，常采用以下方法进行壮苗处理：一是培养温