离子交换柱交换层析法分离氨基酸

离子交换柱色谱法分离氨基酸首先，实验原理离子交换色谱是一种分离技术，它利用离子交换剂的不同亲和力(静电引力)来分离各种离子，以达到分离的目的。离子交换色谱的固定相是离子交换剂，流动相是具有一定酸碱度和离子强度的电解质溶液。阳离子或阴离子与树脂(惰性载体)结合后，可以与阴离子或阳离子结合。如果溶液的离子强度改变，这种离子结合将再次解离。由于不同的氨基酸在不同的酸碱度和离子强度溶液中具有不同的电荷，它们对离子交换树脂的亲和力也不同。从而在洗脱过程中依次被洗去，达到分离的目的。首先洗脱电荷量小且与交换剂亲和力低的那些，而后洗脱电荷量大且与交换剂亲和力高的那些。本实验采用Amberlite IR-120阳离子交换树脂作为离子交换剂，分离出的样品为天冬氨酸和赖氨酸的混合物。在一定的pH值下，Asp和Lys的电荷不同，对磺酸基的亲和力也不同，因此洗脱顺序也不同。每个收集管用茚三酮显色后，测量吸光度，得到洗脱曲线。二。实验设备实验仪器：色谱柱、恒流泵、试管*30、移液管、移液枪、烧杯、紫外分光光度计实验试剂：Amberlite IR-120阳离子交换树脂、柠檬酸缓冲液(pH5.3)、0.5%茚三酮、0.1%硫酸铜、氨基酸样品(0.005摩尔/升Asp和Lys，用0.02摩尔/升盐酸制备)三、实验操作记录1.树脂处理将干燥的树脂用蒸馏水膨胀，倒出细小颗粒，然后依次用4倍体积的2ml/L盐酸和2ml/L氢氧化钠浸泡洗涤2小时，分别用蒸馏水洗涤至中性。用1摩尔/升氢氧化钠再浸泡半小时(转化)，用蒸馏水洗涤至中性。2.安装色谱柱前的准备工作选择直径1cm、长度15-20 cm的色谱柱，观察柱底滤膜是否完好，分别用自来水和蒸馏水冲洗。色谱柱垂直安装在铁架上，在柱的进水口和出水口安装橡胶管，关闭柱底端的出口，向柱内注入少量(约1cm高)洗脱液，打开出水口，排空管内空气后关闭出水口。3.立柱安装向装有处理过的树脂的烧杯中加入适量的洗脱液，用玻璃棒轻轻搅拌树脂成悬浮液，然后小心地将其沿色谱柱内壁添加到适当的高度。浇注速度不能太快，以免产生泡沫和气泡。当树脂在柱底部有明显沉积(约1cm高)后，慢慢打开出口(或用滴管从柱上层吸出过量的洗脱液)，继续加入树脂，直至树脂沉积达到5cm高。色谱柱装填应连续、均匀、无字迹和气泡，表面平整，液面不得低于树脂表面；否则，应重新加载色谱柱。4.平衡色谱柱安装完毕后，连接一个流量可调的恒流泵，用流速为0.4毫升/分钟的洗脱液进行平衡，直至流出液的酸碱度与洗脱液的酸碱度相同(大约需要柱床体积的2-3倍)。5.添加样本关闭恒流泵，关闭色谱柱底部的出口，取下色谱柱顶部的出口塞，慢慢打开色谱柱底部的出口，当色谱柱中的液体流向色谱柱床面时，立即小心关闭出口。使用移液枪吸取0.5毫升样品液体，并沿色谱柱内壁缓慢添加到色谱柱中，以避免损坏树脂表面。添加样品后，慢慢打开色谱柱底部的出口，将液位降至树脂表面的水平，然后关闭。吸收少量缓冲液冲洗柱内壁数次，向约3 4厘米的液层加入缓冲液，并连接恒流泵。添加样品时，应注意避免穿透树脂表面，并避免将所有样品添加到某一限度0.5%茚三酮1.01.01.01.01.01.01.00.1%硫酸铜3.03.03.03.03.03.03.0570纳米0.0000.0150.4390.8850.0410.0890.090试剂/毫升78910111213试料溶液1.01.01.01.01.01.01.0缓冲溶液0.5%茚三酮1.01.01.01.01.01.01.00.1%硫酸铜3.03.03.03.03.03.03.0570纳米0.1010.1040.0840.1380.1110.1220.0942.洗脱曲线根据需要绘制洗脱曲线：V.分析和讨论1.从洗脱曲线中，我们可以大致看到有两个洗脱峰：当第一个峰出现在约12mL时，这个峰的形状是明显的，峰窄而高，上升和下降是陡峭的。判断应为Asp的洗脱峰。因为Asp的pI为2.97，而Asp的负电荷在pH5.3时被阳离子交换树脂的磺酸基团排斥，所以它将优先洗脱。由于静电排斥，Asp洗脱迅速而强烈，因此峰形窄而高。当第二个峰出现在大约40mL时，这个峰相对平坦并且难以区分。从洗脱曲线可以看出，吸光度在20-52mL之间变化不大，在48mL处也有小的波动，因此很难判断峰出现在哪里。第二个峰应该是赖氨酸的洗脱峰。赖氨酸的等电点为9.74，当酸碱度为5.3时带正电荷。赖氨酸与树脂中的磺酸基有很高的亲和力，所以当它通过树脂时会被树脂吸附。此后，在洗脱液的洗涤下，它逐渐从树脂中分离出来以洗脱。推测起来，因为只有重力和洗脱液的影响是促进Lys洗脱的因素，与具有静电排斥的Asp不同，洗脱相对较慢，因此峰是平的且不明显，并且持续很长时间。2.峰值出现在这个实验的后期。第一个峰出现在第三个试管中(其他学生大多出现在第二个