细胞自噬与肿瘤

.,细胞自噬与肿瘤,.,一、自噬简介二、自噬研究方法三、自噬与肿瘤的关系,目录,.,一、自噬简介,1.1自噬过程(1)在饥饿、氧化应激损伤等情况下，自噬体膜脱落形成杯状分隔膜，包绕在被降解物周围；(2)分隔膜逐渐延伸，将要被降解的胞浆成分完全包绕形成双层膜自噬体；(3)自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体并降解其内成分，自噬体膜脱落再循环利用。,.,自噬过程,2.1自噬的功能：（1）对外源性刺激的适应性反应；（2）细胞保持稳定状态的管家机制；（3）参与一定的组织特异性融合；（4）作为一种细胞死亡程序诱导细胞主动性死亡。,.,自噬发生过程的分子机制,.,自噬的研究方法,目前普遍采用的自噬检测方法包括电镜、免疫荧光、蛋白质印迹等方法检测自噬体及其标志蛋白。准确评估自噬不仅包括自噬体的检测，还包括动态观察整个自噬性降解的过程是否顺畅(即自噬潮分析)。另外，通过药物或基因干预技术来人为地调控自噬以观察其在体内体外模型中的作用也是自噬分析的重要内容。任何一种方法单独应用均不能作为自噬的依据，不能将自噬体的增多减少或自噬相关蛋白表达的高低等同于自噬的增强或减弱1。,.,1、自噬性结构的电镜下形态学观察透射电子显微镜是观察自噬现象的最直接、最经典的方法。电镜检测自噬主要是基于辨认自噬体结构。电镜观察仅能证明自噬性结构的存在，难以反映自噬活性的强弱。Swanlund等2介绍了一种免疫金电镜技术来对电镜结果进行定量分析。通过图像分析软件自动测量所有自噬囊泡的面积(m2)，如果一个细胞胞浆中被自噬性囊泡所占据的总面积增加，则可说明自噬机制的上调。,.,.,2、基于自噬体标记蛋白LC3的检测方法自噬过程由一系列自噬相关蛋白(Atg蛋白)介导完成，这些蛋白质在自噬体形成的不同阶段发挥作用.。细胞内存在两种形式的LC3蛋白：LC3-和LC3-。当自噬体形成后，LC3-和磷脂酰乙醇胺(PE)偶联形成LC3-并定位于自噬体内膜和外膜。LC3-始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合，因此被用来作为自噬体的标记。,.,2.1、细胞免疫荧光LC3-在胞浆内弥散分布，LC3-聚集于自噬体膜上，通过免疫荧光的方法检测内源性LC3或转染GFP-LC3融合蛋白的表达，自噬诱导后的细胞表现为点状聚集增多。理论上，观察到的点状聚集的数目即为自噬体的数量，根据点状聚集的密集程度可以判断细胞自噬的情况。但是这种方法仅从总体上大致反映自噬的增加或减少，定量分析则存在局限性。,.,GFP-LC3单荧光自噬指示体系：,绿色斑点增多也并不一定代表自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻，可以通过westernblot检测游离的GFP、p62来验证。,.,2.2、LC3蛋白转化实验自噬发生后，通过Western-blot可以检测到两个条带的蛋白质。由于在自噬时细胞内LC3蛋白总的表达水平其实并无上调，仅仅是一部分LC3-转变成了LC3-，那么理论上自噬时应表现为LC3-的减少和LC3-的增加，通过LC3-/LC3-或者LC3-/(LC3-+LC3-)即可反映自噬水平。,.,但是由于二者对抗体结合能力的差异导致检测敏感性的不同(LC3-检测敏感性高于LC3-)，实际检测结果LC3-的减少并不与LC3-的增加同步，因此单纯比较LC3-蛋白的水平可能更好。,.,3、基于自噬性降解的检测“自噬潮”分析自噬过程是动态变化的，想要说明细胞自噬活性的强弱，必须通观整个自噬的过程是否顺利，即通过基于自噬性降解的自噬潮分析来进一步说明自噬活性。自噬潮涵盖了自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程。显然，对这整个过程进行监测比单纯自噬体检测更能反映自噬活性，因此“自噬潮”分析是反映自噬活性的可靠指标。,.,3.1、长寿命蛋白降解根据自噬机制主要负责降解长寿命蛋白的特性，先让细胞在含有同位素标记氨基酸的培养基中生长一段时间，细胞在此期间合成的蛋白质都将被同位素标记，然后换成不含同位素的培养基，让一些被标记的短寿命蛋白通过蛋白酶体途径降解。在自噬诱导后，通过检测培养基上清中释放的自噬性降解产物的放射性活度即可反映细胞自噬性降解的能力。,.,3.2、LC3和其他自噬性底物的降解自噬过程中，自噬体内膜上的LC3-被溶酶体降解，通过免疫印迹监测自噬过程中LC3蛋白量的变化或流式细胞仪监测GFP-LC3荧光强度的变化即可反映自噬活性。在自噬诱导一开始，GFP-LC3点状聚集显著增多，随后信号可能会出现下降，代表着自噬性降解的发生。,.,3.3、mRFP-GFP-LC3的溶酶体呈递,mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系：,.,3.4、GFP-LC3切割LC3连同自噬体内膜和内容物一起被溶酶体降解，但GFP在溶酶体中仅表现荧光信号猝灭，GFP本身并不被降解，在自噬性溶酶体降解后会释放出游离的GFP。通过免疫印迹的方法检测游离GFP蛋白的出现即意味着自噬性降解的发生。,.,4、自噬的实验性调控通过人为的干预来激活或者抑制自噬功能后观察细胞行为或效应分子的变化能够使研究结论更具有说服力。目前，实验性激活或者抑制自噬的方法有药物处理、自噬基因敲除、沉默或过表达。常用的自噬激活剂：雷他霉素、营养缺乏、Lithum常用的自噬抑制剂：3-MA、氯化铵、BafilomycinA1,.,自噬与肿瘤的关系,自噬在肿瘤治疗中有双重作用：作为肿瘤抑制机制，自噬可以导致细胞死亡、限制细胞数量，或者减少DNA的突变概率，以防止肿瘤形成；作为肿瘤保护机制，自噬可以保护癌细胞免受化疗药物的作用并延缓肿瘤细胞凋亡3。自噬可以抑制肿瘤，例如葡萄籽原花青素诱导肝癌细胞自噬性死亡4，硅胶纳米颗粒通过活性氧诱导细胞自噬及自噬性死亡5。另外，有研究显示，在多种应激状况下，自噬可以提高细胞存活6。例如，肿瘤进展造成局部缺氧和营养匮乏，此时自噬水平升高以增加肿瘤细胞存活7。,.,参考文献,1马泰,孙国平,李家斌.细胞自噬的研究方法J.生物化学与生物物理进展,2012,39(3):204-209.2ChenN,Karantza-WadsworthV.RoleandregulationofautophagyincancerJ.BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-MolecularCellResearch,2009,1793(9):1516-1523.3石文沽,刘凯,陈德喜,等.自噬与肝癌J.北京医学,2011,33(12).4王威,陈景红,王新宁,等.葡萄籽原花青素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及自噬性死亡J.暨南大学学报(自然科学与医学版),2011,32(2).5SharmaV,AndersonD,DhawanA.ZincoxidenanoparticlesinduceoxidativeDNAdamageandROS-triggeredmitochondriamediatedapoptosisinhumanlivercells(HepG2)J.Apoptosis,2012,17(8):852-870.6KroemerG,MarioG,LevineB.AutophagyandtheintegratedstressresponseJ.Molecularcell,2010,40(2):2