DNA-复制课件

DNA复制(DNAReplication),2.1.基本概念,2.2.复制起点与方向,2.3.Semi-ConservationReplication,2.4.复制的方式,2.5.线状DNA的复制,2.6.DNA复制的基因与酶类体系,2.7.DNA复制速率及拷贝数的调控,2.1基本概念(BasicConcept),遗传物质的分子机制,分子生物学的核心,Watson,Replisome;,AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminator,Themultiprotein(30)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA,DNAreplicationatphaseSofcellcycle,E.coli37,0.5h,105bp/min,S6-8hs,M,1h,G2,3-4hs,mammaliancell,22-25hrs,500-5000bp/min,G1,12hs,2.2.复制起点与方向（replicationorigin&direction）,isolationofori,概念：DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用ori(或o）表示。许多生物的复制原点都是富含A、T的区段。,复制叉的形成,GATCTNTTNTTTTTTATNCANA313bp直接重复序列DnaA结合位点，49bp大肠杆菌DNA复制起始点（oriC）保守序列分布图,K=G/T,S=C/G,andY=C/T.,复制叉的形成,互相缠绕的双链母本DNA，复制从特定的位置(复制原点OriorO)开始，该位置常是富含A、T区段。,复制叉的形成,DnaA蛋白可识别复制起点并与之结合，这是随后起始事件的基础。一旦结合复制起点DNA，DnaA蛋白会获得额外的性质：1、可促进DNA扭曲，使螺旋酶能进入；2、可帮助其它与复制叉组装有关因子进入。,复制叉的形成,DnaA蛋白作用于oriC左侧的的3个13bp的串联重复序列，使这3个13bp解链，这个过程需能（ATP）；,然后是DnaB的进入，DnaB实际上是使DNA解链的螺旋酶，取代13bp处的DnaA蛋白，并与DNA旋转酶协同作用，促使大范围的解链；SSB蛋白结合到单链DNA上，稳定单链DNA。,ATCG,G,5ppp,因能量的需要，DNA的5端必须带有PPP,游离dNTP具有ppp,pppOH3,ATCG,在0.2MNaCl的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP难以聚合到DNA的5端，而且双链DNA的5端碱基配对困难需要其他机制以解脱,OH,OH3,碱基发生错配后的校正,费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗,pp,OH,OH,ATCG,2.3.DNA的半保留复制（Semi-ConservationReplication）,半不连续复制（semi-discontinuousreplication）,证据dumpfragmentinDNA,2.4.DNA复制的方式(DNAreplicationmodel),primer,(DNA聚合酶不能发动子链DNA的复制起始),S.S.DNAvirus,RF,无M13RF,Rifampin,M13,Rifampin,有M13RF,有M13RF,M13,Rifampin,DNA复制的转录激活(transcriptionalactivation）,RNApolymeraseRifS,10NtRNAprimerforleadingStrand,origin,dnaG,primaseRifRforlaggingStrand,DNA新起始方式（denovoinitiation）复制的基本模式,ParentalD.S,DNA,Unwindingprotein,RNApolymerasePrimase,DNApolymerase,leadingStrand,laggingStrand,Elongationoflag.&lea.strands,DNApolymerase,Poly(dNt)ligase,Replicationloop,RNAprimer,RNA-primedDNApieces(1kb),Continuous5to3inLeadingS.Discontinuous3to5inlaggingS.,TwolongDNApiecesManyshorterDNApieces(1-2kb),Repair&fillingin5to3,Bidirectionallengtheningofnewstands,共价延伸方式（covalenceelongation）,或滚环方式（rollingcircle）,D.S.DNA,Nick,leadingStrand,Elongation,rolling,LaggingStrand(form),InmitochondrialDNAalsoinchloroplastDNA,复制叉两侧DNA双螺旋的解旋,E.coliC/genome=3.2106bp,40分钟/每次复制历时,10bp/每圈螺旋84000bp解旋/分(8400rpm!高速离心机),DNAtopoisomeraseIDNA的单链瞬间断裂（transientsingle-strandbreak）缓解高速旋转,DNAtopoisomeraseIIDNA的双链瞬间断裂（transientdouble-strandbreak）缓解高速解旋时，DNA双链的相互缠绕,z,TopI,TopII,Helicase(repprotein),SingleStrandBindingprotein(SSB),Helixdestabilizingprotein(HDP),DnaBprotein,DnaCprotein,Primase,Ung-ase,DNAPolymeraseIII,DNAPolymeraseI,Ligase,forprimosome,复制体,进化中形成了灵活的多酶复合体replisome,2.5.线状DNA的复制及避免5末端短缩的模式,WatsonJ.DT7phage,DirectrepeatintheendoflinearDNA,ConcatermerbetweentwooffspringDNAafterreplication,(100dNtterminalredundancy),机制二：进入宿主前就环化机制三：末端冗余还有其他方式。,真核生物染色体DNA末端补齐模式,端粒的发现,1938MullerX-rayDrosophila,末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定.并定名为Telomere,1938B.McClintock顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。推测染色体末端具有特殊端粒结构。,1970s分子生物学发展端粒研究获得突破,端粒DNA(Telomer),TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端,5TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3(richGchain)3AACCCCAACCCCAACCCC5(richCchain),1985.CarolGreider&Blackburn,1986.Gottchling,尖毛虫telomerebindingprotein155kdtelomerebindingprotein226kd四膜虫telomerase将T2G4末端重复延伸游扑虫Telomerase=RNACAAAACCCC链+末端结合蛋白（TBP）,+100bptelomere,线虫：TTAGGC重复70次人鼠：TTAGGG重复2000次,端粒（Telomere）：真核细胞内染色体末端的蛋白质-DNA结构，其功能是完成染色体末端的复制，使染色体免遭融合、重组和降解。端粒酶(Telomerase)一种核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白质两种成分组成，催化端粒DNA的合成，能够在缺少DNA模板的情况下延伸端粒寡核苷酸片段。,端粒酶是一种特殊的DNA聚合酶：（既具有蛋白质也有RNA分子，该RNA携带关键模板信息！）自身携带RNA模板的反转录酶,转位、延伸,G链T2G4-TTGGGGTTGGGG,C链-A2C4-,TTG,telomerase,3,aaaAACCCCAACuuac-5,GGGTTG,TTG,GGGTTG,-,telomerase,3,aaAACCCCAACuuac-5,WhenG-richstrandislongerenough,G链T2G4-TTGGGGttggggttgC链-A2C4-AACCCCAAggggtt,g,g,g,or,人大多数细胞缺乏端粒酶，端粒长度随衰老而缩短，而生殖/种系干细胞则保留端粒酶；这是衰老原因。肿瘤细胞具有端粒酶活性。,长短,细胞分裂次数与端粒长短呈正比,细胞分裂,端粒阈值,端粒长短端粒酶活,Harley(1989)端粒的重复片段为探针检测,年龄,小大,端粒长度,早老性侏儒症的端粒明显较正常人短,“多莉”的衰老,PCD机制、癌细胞的无限繁殖,2.7.DNA的复制基