第十三章基因工程与基因重组-PowerPointPre.ppt

第十三章基因重组与基因工程,第一节自然界的基因重组一转化（transformation）1943年Avery等，研究肺炎双球菌时发现，有毒型肺炎双球菌的DNA和无毒型肺炎双球菌一起培养产生子代有毒型肺炎双球菌。,病毒和噬菌体是最简单的生物，由蛋白质包裹着核酸组成。噬菌体感染宿主细胞后，噬菌体核酸进入宿主细胞过程叫转染（transfection），是转化的一种形是。如癌基因随病毒基因整合到宿主细胞的染色体中，癌基因被转录，并翻译为蛋白质，此特异蛋白质使正常宿主细胞转变为癌细胞。,二转导（transduction）噬菌体感染大肠杆菌时，DNA进入宿主细胞，与宿主细胞染色体重组成一体，叫作整合，整合的细菌叫溶原菌，另一种方式叫裂解。,三转位（transposition）转位是一组基因从一处转位到基因组的另一个位置，免疫球蛋白的生产就是通过基因转位和重组而生产的过程。,第二节基因工程,基因工程是用分离纯化或人工合成的DNA，在体外与载体DNA结合，成为重组DNA，用于转化宿主（细菌或其它细胞），筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、转代、扩增，成为克隆（clong）。因此，基因工程也称为基因克隆（genecloning）或重组DNA技术。基因克隆（或重组DNA）技术，既然是个工程，就应有蓝图和施工方案。首先要考虑的是达到什麽目的，如是想扩增基因研究还是用此基因生产蛋白质。,基因克隆技术示意图：,一分载体和目的基因的分离（一）载体常用的有质粒、噬菌体、M13噬菌体等。逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA，是近年用于插入动物细胞较新载体，这些载体多是在宿主细胞内可独立复制完整DNA分子。pBR322是常用质粒。,噬菌体和噬菌体又称大肠杆菌噬菌体。噬菌体由可壳蛋白包裹着49502个碱基对的DNA，还有一个尾巴。DNA共有50多个基因。,（二）目的基因的来源1.直接从染色体中分离;2.人工合成;3.从mRNA合成cDNA;4.基因文库(genelibrary)。,二切限制性内切酶的应用有人把限制性内切酶称作基因工程的手术刀，它能识别核酸分子莫些碱基序列并加以切开。分平端切口和粘端切口。,三接把载体和目的基因接成重组基因限制性内切酶切割载体及目的基因后，无论产生平端切口或粘端切口，都可以用DNA连接酶把载体和目的基因接成重组基因。,还有一种尾接法的连接方法，在载体和目的基因上找不到共同的酶切点时，采用此法。,四转重组体的转化重组载体如大肠杆菌质粒，可在04C用CaCI2处理大肠杆菌，以增大其细胞膜的通透性，而后将用CaCI2处理的杆菌与重组质粒进行保温，使质粒进入菌体，将DNA片段导入宿主细胞进行转化。,基因工程技术的发展，特别是高等动物的基因难于在原核生物体系中表达，因二者的转录、翻译系统各有差异，目前基因工程的表达体系已发站到第二、三、四代：,五筛DNA重组体筛选与鉴定将重组载体引入宿主细胞，并将其初步扩增后，应加以筛选，筛出含目的基因的菌株，并鉴定之，确定克隆株后，即可繁殖菌株进行扩增。1.据重组载体的表型进行是常用方法。可以利用载体质粒对抗生素的抗药性进行筛选。如质粒pBR332，由4362个核苷酸对构成对四环素及氨苄青霉素均有耐药性。,2.DNA限制酶切图谱分析：如用快速的DNA提取法提取重组DNA，经限制性内切酶切割后，在琼脂糖凝胶电泳上比较重组体与原来载体，可以从DNA片段的大小与有无来区别是否已发生重组。3.利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：将菌落DNA转移到硝酸纤维素滤膜上，另外用放射同位素，标记目的基因，制成溶液，作为“探针”将菌落DNA与“探针”一起温育，若菌落含有目的基因，就可把“探针”吸附住，把已和探针溶液作用过的滤膜冲洗、烘干，与线底片夹在一起放阴暗处数天，经显影后，有目的基因的所在位置会出现黑点，从黑点位置与菌落DNA比较及鉴定之。,基因工程是生命科学中目前的热门课题，方法日新月异，总的操作原则归纳如下：,生物技术（biotechnology）即生物工程，是利用有机体或其组织发展新产品的一种技术。,单克隆抗体（monoclonalantibody）是由一个杂交瘤细胞及其后代，产