克隆基因表达--原核表达

1,克隆基因表达原核表达,2,基因克隆的意义通过外源DNA的重组、克隆以及鉴定，获得大量的需要的特异DNA克隆；外源克隆基因在某种表达载体及适宜的宿主细胞中表达相应的蛋白质。,3,目的基因克隆载体表达载体受体细胞（宿主细胞）表达产物的分离和纯化,表达体系,4,最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。这就要求选择合适的宿主细胞，合适的表达载体和适当的纯化方案。,5,宿主细胞应满足以下要求：,容易获得较高浓度的细胞且利用易得廉价原料不致病、不产生内毒素发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态容易进行DNA重组技术操作和代谢调控产物的产量、产率高且易于提取纯化,6,一、原核细胞：大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；,宿主细胞分类,二、真核细胞：酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞。,7,第一节 外源基因表达,一、原核生物表达体系二、真核生物表达体系,8,一、原核生物表达体系,9,经过长期的研究，已经掌握了有关大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对基因表达调控的分子机理；被发展成为安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；许多克隆的真核基因，如生长素和胰岛素基因等已实现有效的、高水平的表达；大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进行工业化批量生产。,大肠杆菌表达体系的特点,10,（一）对外源目的基因的要求,（1）利用大肠杆菌表达真核基因存在问题结构上存在很大的区别转译起始信号不同mRNA分子结构的不同原核生物缺乏转译后的修饰过程细菌的蛋白酶能识别目的蛋白并将其降解,真核基因含有的内含子，可在基因转录过程被RNA酶催体系剪辑删除掉,真核启动子缺乏结合细菌核糖体所必须的SD序列；细菌的RNA聚合酶不能识别真核启动子,真核基因mRNA分子的5端帽子和3端尾巴结构影响其在原核中的稳定性和与核糖体结合的能力,细菌缺乏对真核基因的蛋白产物正确折叠和组装过程，表达产物要经过复性,异源性蛋白,11,（一）对外源目的基因的要求,（2） 外源目的基因的基本要求不含有内含子结构（cDNA或是mRNA）不具有5端非编码区,12,（二）原核生物表达载体,（1） 克隆基因正确表达的基本条件能够进行正常的转录能够进行有效的转译,目的基因必须克隆至原核启动子后；3末端具有原核终止子,含有原核起始密码子和SD序列，使mRNA分子能正常转译,13,（二）原核生物表达载体,（2） 原核生物表达载体的特点载体能够独立复制，具有复制子应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。以利于外源基因的克隆鉴定和筛选应具有强启动子（可调控的，诱导时进行转录）、翻译的起始密码子AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译应具有强终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定转译增强子序列（显著增强异源基因表达效率）,14,表达载体的一般结构,15,具有复制子有多克隆位点有选择性遗传标记如抗药基因,克隆载体,16,（三）真核生物基因在原核细胞中的表达,（1） 依据表达方式不同分类非融合型表达蛋白 优点：表达的非融合蛋白与天然状态下存 在的蛋白在结构、功能以及免疫原性等方面基本一致 缺点：易被细菌蛋白酶破坏,17,常用的非融合型表达载体pKK223-3抗氨苄青霉素基因 Tac启动子 SD序列 AUG起始密码转录终止序列T1和T2,18,融合型表达蛋白 含义：指蛋白质的N端由原核生物DNA序列或其他DNA序列编码（标签蛋白），C端由真核生物DNA序列编码 优点：融合蛋白具有抗原性可以作为抗原，利于蛋白产物的鉴定和纯化；稳定外源蛋白防止细菌蛋白酶的破坏；标签蛋白可被蛋白酶切割 注意问题：外源基因的阅读框架必须与标签蛋白的阅读框架相符合,19,融合型表达系统主要有：金黄色葡萄球菌蛋白A系统His系统GST系统-半乳糖苷酶系统麦芽糖结合蛋白系统,20,21,（三）真核生物基因在原核细胞中的表达,（2） 依据表达形式不同分类分泌型表达蛋白可溶性表达 优点：防止被宿主蛋白酶降解；减轻大肠杆菌代谢负荷；易于恢复表达产物的天然构象 常用分泌型表达载体：PIN,22,23,不可溶性表达包涵体 含义：是大肠杆菌高效表达外源基因时形成的由膜包裹的高密度、不溶性和无活性、大小为0.51um的蛋白质颗粒 特点：表达量高且易于分离纯化，但需要复性。,24,1.包涵体的形成原因表达产率过高，超过了细菌正常的蛋白水解能力，导致产物聚集；原核生物缺乏翻译后修饰加工所需酶类和辅助因子，使中间产物大量积聚而形成包涵体；发酵温度过高或胞内pH接近蛋白的等电点时易于形成包涵体。,25,2.包涵体的分离与纯化常用的裂解方法有机械破碎法、溶菌酶法、超声破碎法等；包涵体溶解的原理：加入强蛋白质变性剂，通过离子间的相互作用，使包涵体蛋白分子内和分子间的各种化学键断裂而易于溶解；常用的变性剂有：盐酸胍（58mmol/L）、尿素（58mmol/L）等。,26,3.包涵体蛋白质的复性含义：包涵体中蛋白质必须恢复其生物活性，通过逐步降低变性剂浓度，可使表达蛋白恢复其天然构型；常用方法：稀释复性、透析复性、超滤复性和柱上复性等，为了提高复性率，可采用氧化还原系统、添加低分子化合物、分子伴侣和折叠酶等。,27,（三）真核生物基因在原核细胞中的表达,（3） 外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位细胞质中表达分泌表达至细胞周质中分泌表达至胞外培养基中,28,大肠杆菌表达系统存在的不足,由于缺乏转录加工的机制，因此只适合表达克隆cDNA，不宜表达真核基因组DNA；由于缺乏适当的翻译后加工机制，因此只适合表达翻译后不需进行加工的真核蛋白，或无需翻译后加工也不影响生物活性的真核蛋白；表达蛋白易于形成不溶性的包涵体，需经过变性、复性处理才能恢复生物活性；分泌表达至细胞周质或培养液中的蛋白质，产量不高；表达的真核蛋白易于被细菌蛋白酶降解,29,例：利用重组大肠杆菌生产人胰岛素,胰岛素的结构及其生物合成人胰岛素的生产