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文档简介

实验二PCR产物的纯化,【实验目的】通过本实验学习PCR产物纯化的原理与实验技术，为后续的连接反应和转化反应打下良好的基础。,【实验原理】本实验采用了Takara公司的AgaroseGelDNAPurificationKit试剂盒。该试剂盒采用了独特的凝胶融解系统，结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需30分钟便可完成。回收纯化的DNA片段纯度高，完整性好，可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测序等各种分子生物学实验。,【仪器与试剂】一、实验仪器1、琼脂糖凝胶电泳系统2、紫外观察分析仪（波长302nm）3、离心机（Eppendoff）4、单面刀片,二、【试剂】1、TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.02、50TAE3、ddH2O,【实验步骤】1、使用1TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。2、在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减少凝胶体积，提高DNA回收率。注：切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。,3、称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg1L进行计算。4、向胶块中加入胶块融化液DRIBuffer，DRIBuffer的加量如下表：,5、均匀混和后，75加热融化胶块。间断振荡混和，使胶块充分融化（约610分钟）。注：胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。6、向上述胶块融化液中加入DRIIBuffer（体积为DRIBuffer的1/2），均匀混和。7、将试剂盒中的SpinColumn按置于CollectionTube上。8、将上述操作6.的溶液转移至SpinColumn中，3600rpm离心1分钟，弃滤液。注：如将滤液再加入SpinColumn中离心一次，可以提高DNA的回收率。,9、将500L的RinseA加入SpinColumn中，3600rpm离心30秒，弃滤液。10、将700L的RinseB加入SpinColumn中，3600rpm离心30秒，弃滤液11、重复操作步骤10.，然后12.000rpm再离心1分钟。12、将SpinColumn按置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入25L的水，室温静置1分钟。注：把水加热至60，使用时有利于提高洗脱液效率。13、12.000rpm离心1分钟，洗脱D
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