9蛋白质的化学修饰.ppt

化学修饰的原理,化学修饰的方法学,蛋白质侧链的修饰,蛋白质肽链的交联,亲和标记,蛋白质化学修饰的应用,内容提要,（第九讲）,三、羧基的修饰,用水溶性碳二亚胺作催化剂，通过胺专一地修饰蛋白质中的羧基。,+,+HX,+,碳二亚胺,形成相应酰胺,重排,四、巯基的修饰,由于半胱氨酸时蛋白质中反应性最强的残基，所以很多试剂可用来修饰巯基侧链。,常用的有三类：,1.碘乙酸、碘乙酰胺或环乙烯亚胺,2.马来酰亚胺或马来酸酐,3.有机汞试剂,（一）1类试剂是烷化剂，此类试剂还能与甲硫氨酸、赖氨酸或组氨酸反应。,pH7,碘乙酸,半胱氨酸,副反应：,pH5.5,组氨酸,pH=28.5,pH=8.5,甲硫氨酸,（二）2类试剂能与巯基形成对酸稳定的衍生物，而与其它基团形成的产物则对酸不稳定。,+,pH5,副反应：,+,pH7,半胱氨酸,（三）3类试剂对巯基专一性最强。常用的是对氯汞苯甲酸，S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸是对氯汞苯甲酸的衍生物，也可与巯基反应。,马来酸酐,+,对氯汞苯甲酸,+,S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸,（四）5，5-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）也常用于修饰巯基，它与半胱氨酸形成混合二硫化物。,+,pH6.5,+,DTNB,2-硝基-5-硫代苯甲酸,释放出的2-硝基-5-硫代苯甲酸阴离子在412nm处有吸收，可用光谱法测定其含量。,五、组氨酸咪唑基的修饰,常用试剂是焦碳酸二乙酯和碘乙酸。,1-羧乙基组氨酸,3-羧乙基组氨酸,1，3-二羧乙基组氨酸,+,pH47,+,焦碳酸二乙酯,碘乙酸,用碘乙酸烷化组氨酸残基可得单取代或双取代衍生物。,焦碳酸二乙酯能使咪唑环上的一个氮原子羧乙基化.,羟胺可使反应可逆进行，回收组氨酸。,+,pH=7,+,羟胺,六、色氨酸吲哚基的修饰,（一）N-溴琥珀酰亚胺（NBS）常用来修饰色氨酸。,它氧化吲哚基成为羟吲哚衍生物。酪氨酸也能与NBS作用。,（二）各种苄基卤化物能使吲哚环烷基化,最常用的是2-羟基-5-硝基苄基溴，由于溶解度的问题，常用它的类似物二甲基（2-羟基-5-硝基苄基）锍盐。,应注意的问题,该试剂在水介质、高pH下不稳定，迅速水解为CO2和乙醇。,试剂大大过量时可与咪唑环上的两个氮都作用，形成双取代衍生物。,羟胺不能使双取代物发生可逆反应，而是清除咪唑环。,2-羟基-5-硝基苄基溴,+,pH7.5,+HBr,醋酸,+,+H+Cl-,对氯硫硝基苯,带硝基苯取代基的硫基卤化物的专一性与锍盐类似，但能产生单一产物，避免了锍盐修饰产物的不均一性，而且产物的光谱性质可用来定量测定色氨酸。,七、酪氨酸酚基的修饰,四硝基甲烷在温和条件下可高度专一地硝化酪氨酸残基，产生可电离的发色基团3-硝基酪氨酸。,色氨酸,八、甲硫氨酸甲硫基的修饰,用H2O2和过甲酸可将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜，用碘乙酸烷化甲硫氨酸残基，能形成正甲硫盐。,九、丝氨酸羟基的修饰,甲苯磺酰氟（PMSF)可与丝氨酸残基作用。,+,+,四硝基甲烷,3-硝基酪氨酸,试剂,修饰的侧链,LysGluCysArgSerHisTyrTrpMet,醋酸酐,酰基酸酐,醛,N-溴琥珀酰亚胺,碳二亚胺,苯异硫氰,四硝基甲烷,三硝基苯磺酸,焦碳酸二乙酯,碘乙酸,环乙烯亚胺,甲苯磺酰氟,马来酰胺,常用重要修饰剂的专一性,第四节蛋白质肽链的交联,双功能试剂：具有两个反应活性部位，可以在相隔较近的两个氨基酸残基间搭桥、形成多肽链内、多肽链间或者蛋白质分子之间的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。,一、设计或选择交联剂要考虑的因素,（一）反应的专一性,交联剂分为,同型双功能试剂,异型双功能试剂,（二）交联距离,随着交联剂两个功能基之间距离跨度的增加，形成交联的可能性也随之增加。,（三）可裂解性,研制可裂解交联剂有助于分离和表征交联片断。,（四）反应活性部分,可以在某种程度上控制交联剂的反应部位，可以通过交联剂反应活性部位的疏水性、亲水性或电荷来控制反应。,二、交联剂的类型,交联剂类型,同型双功能试剂,异型双功能试剂,可被光活化试剂.,可裂解性,不可裂解性,反应基团,间隔基团,反应基团,同型双功能试剂,(CH2)n，长度可变,异型双功能试剂,（-S-（CH2）n-）2,可被硫醇裂解长度可变,可被高碘酸裂解,亚氨酯,光活化双功能试剂,能与胺反应的基团,能与巯基反应的基团,（一）同型双功能试剂,交联剂两端具有相同的反应活性部分。,双亚氨酯，可与氨基反应。两端间的间隔基团是（CH2）n,若间隔基团含有二硫桥，则成为可裂解同型双功能试剂。,所有同型双功能试剂都对氨基有专一性，但戊二醛例外，它除了与氨基反应外，还可与羟基反应。,双亚氨酸酯（非裂解）,二甲基-3，3-二硫代-双丙基亚氨酯（可裂解）,（二）异型双功能试剂,这类试剂的一端与氨基作用，另一端与巯基侧链作用，但用碳二亚胺时，另一端反应基团是羧基。,这类交联剂的一端含有氨基反应部分，N-羟琥珀酰亚胺，另一端含有巯基反应部分，马来酰亚胺或联硫基。,N-羟琥珀酰亚胺辛二酸酯（非裂解）,N-琥珀酰胺-3-（2-吡啶二硫代)丙酸酯,（三）可被光活化的试剂,这类试剂是异型双功能试剂的扩展。,当交联剂一端的反应基团与蛋白质作用之后，经光照另一端则产生一个反应活性部分，这部分即可是碳烯，也可是氮烯。,这类交联剂一端一般含有能与氨基或巯基反应的基团，而另一端则含有对光敏感的基团。,三、交联剂的使用,蛋白质与交联剂的反应直接有助于蛋白质构象的稳定性,交联剂可用来测定蛋白质亚基的量,能形成分子间的交联键，使蛋白质对变性稳定。,两种酶通过交联形成杂化酶。,交联可提高酶分子构象的稳定性。,可测定齐聚体蛋白质的分子量和亚基数目。,测定蛋白质上残基间的距离。,测定酶的活性部位。,第五节亲和标记,亲和标记：部位专一性标记，是利用酶和底物的亲和性，使用与酶底物类似的修饰剂，对酶活性部位上的氨基酸残基进行共价标记。,亲和试剂作为底物类似物的标准：,1.在使蛋白质不可逆失活以前，亲和试剂要与酶形成可逆复合物；,2.亲和试剂的修饰程度是有限的；,3.没有反应性的竞争性配位体的存在，应减弱亲和试剂的反应速度；,4.亲和试剂的体积不能太大，否则产生空间位阻；,5.修饰产物应当稳定，便于表征和定量。,亲和试剂分类,内生亲和试剂,外生亲和试剂,一、内生亲和试剂,IO4-,+ENZ-(CH2)4-NH2,NaBH4,O-ATP,与氨基反应,过碘酸氧化的ATP（O-ATP）与氨基侧链的可能反应,希夫碱化合物,+ENZ-(CH2)4-NH2,+ENZ-CH2SH,O-ATP,O-ATP,与巯基反应,与氨基反应,过碘酸氧化的ATP（O-ATP）与赖氨酸侧链的可能反应,过碘酸氧化的ATP（O-ATP）与巯基侧链的可能反应,吗啉型加合物,缺点：产生的二醛几乎全部与赖氨酸侧链反应，不能与更多类型侧链反应。,嘌呤核苷酸的烷基卤化衍生物也可看作是亲和试剂，各种亲和侧链如Cys、His、Lys、Met等能与试剂上的卤原子反应。,ATP,腺苷-5-氯代甲烷焦磷酸酯,腺苷-5-(-磷酸氯乙酯）,Aden-为腺苷,ATP的烷基卤化衍生物,由于这两种试剂的结构与ATP相似，才看作是内生亲和试剂。,二、外生亲和试剂,（一）将卤代烷基衍生物通过腺嘌呤的N-6连到腺嘌呤上，则可形成有效的外生亲和试剂。,N-6-对-溴乙酰胺-苄基-ADP,（二）通过腺嘌呤核苷酸的磷酸基可加入另一类反应基团。,腺苷-5-(对-氟磺酰苯酰磷酸）,这类试剂对赖氨酸和酪氨酸的反应性很强。,合成具有两个反应基的嘌呤核苷酸衍生物，它既含卤代烷基部分又含二羰丁基部分，不仅对能与卤代烷反应的侧链有专一性，还对精氨酸残基有专一性。,（三）光亲和试剂是一类特殊的外生亲和试剂。,优点：光活化产生的自由基（碳烯或氮烯）能无选择地与各类侧链反应。,8-叠氮腺苷三磷酸,芳基叠氮-丙氨酸NAD,试剂中的光亲和基团是通过核糖的羟基连接的。,叠氮衍生物可看作是内生亲和试剂，而芳基叠氮衍生物是外生亲和试剂。,第六节蛋白质氨基酸的敏化光氧化,蛋白质的敏化光氧化：当敏化剂与蛋白质共存时，若用可见光照射，则敏化剂产生化学变化，使蛋白质侧链氧化。,敏化光氧化需分子氧，而启动光氧化反应的是处于激发三重态的敏化剂。,敏化光氧化的反应机理，有两种解释：,1.敏化光氧化并不决定于敏化剂与蛋白质之间的结合。,2.蛋白质先与三重态的敏化剂发生专一性的结合反应，产生自由基离子，再与分子氧反应，形成蛋白质氧化产物。,影响光敏化反应效率和选择性的主要因素是敏化剂对蛋白质的结合作用。,使用能与蛋白质共价结合的敏化剂，可以了解某些氨基酸残基在蛋白质空间构象中配置情况，也可测定蛋白质中包埋的和暴露的基团。,第七节蛋白质化学修饰的应用,一、用来测定蛋白质分子中某种氨基酸的数量,常用方法:,对氯苯甲酸与巯基作用；,三硝基苯磺酸与氨基作用;,荧光胺与氨基作用等。,二、在蛋白质序列分析中的应用,（一）控制酶解程度,用三氟乙酰法将Lys的-NH2保护起来,变成酶不能水解的产物。,通过化学修饰将Cys,转变成S-氨乙酰-Cys,通过化学修饰将Ser,转变成S-氨乙酰-Cys,例如用胰蛋白酶只水解精氨酸形成的肽键。,如果要增加胰蛋白酶水解位置。,还原剂,胱氨酸,半胱氨酸,S-氨乙酰-半胱氨酸基,环乙烯亚胺,丝氨酸基,（二）化学裂解,用