实时荧光定量PCR实验结果分析PPT课件

实时荧光定量PCR实验结果分析,邓椋爻技术支持广州市昊洋贸易有限公司,定量分析绝对定量相对定量,定量PCR应用,定性分析SNP分析，基因扫描阴阳性判定熔解曲线分析,绝对定量：HowMany优点：给出目标基因初始模板的绝对数量，数据容易处理缺点：必须有标准品，做标准曲线应用：病毒拷贝数；转基因的拷贝数；转基因成分百分含量检测,绝对定量与相对定量,相对定量:HowMuch优点：需要/不需要标准品；使用广泛缺点：数据理解困难应用：差异表达分析；芯片评估,14500copies,108,106,102,104,绝对定量,108,106,102,104,绝对定量,绝对定量,108,106,102,104,绝对定量,105copies/well,绝对定量,1/3,Blank,1/3,1/3,1/3,1.11ng/2ul,0.37ng/2ul,0.12ng/2ul,10.0ng/2ul,3.33ng/2ul,相对定量,ControlCT=21.3SampleACT=22.8SampleBCT=19.3,相对定量,ControlCT=21.3=1.5ng/tube1SampleACT=22.8=0.5ng/tube0.33SampleBCT=19.3=6.0ng/tube4,Fold,相对定量,相对定量数据处理,管家基因校准(NormalizationGene)得出每个细胞中的目的基因目标基因vs.管家基因对照样品校准(CalibratorSample)得出相对于某个样品的基因表达量,1Xsample.处理的vs.未处理的，6hrvs.0hr,病理vs.正常.,按比例稀释标准品，根据标准曲线确定样本初始模板浓度至少需要两个标准曲线GOIreferencegene标准曲线确定反应扩增效率,相对定量标准曲线,相对定量,相对定量：CT法,依据：平均相对含量%=2平均CT数据处理：C（t）GOI-C（t）ref=C（t）C（t）sample-C（t）calibrator=C（t）好处：不做标准曲线应用范围：扩增效率较高，目标基因和内标基因扩增效率一致并且相互独立扩增；不做标准曲线，高通量检测（芯片评估）；不要求很高的精度,应用实例-基因表达分析,利用TaqMan技术研究ERBB2在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异,实验设计流程,AurumTotalRNAkit,iScriptcDNASynthesisKit,材料和方法,已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准选用GAPDH作为内标基因FAM标记的ERBB2探针VIC标记的GAPDH探针标准品（质粒）构造标准曲线多重PCR反应阴性对照无RNA对照（空白）无逆转录酶对照（监控基因组污染）,RNA定性及定量分析,一步法两步法,在不同的反应管中运行RT&PCR,25C5min42C30min85C5min冷却至4C,iScriptcDNASynthesisKit,设计qPCR实验方法,5-6oCBelow,10oCAbove,PCR优化-温度确定,预设退火温度,PCR优化-熔解曲线,PCR优化-扩增曲线,RT-qPCR实验,95C,15min94C,15sec60C,1minplatereadgotostep3,39moretimes10C,foreverEnd,目标基因：未知样品生成标准曲线：标准品梯度监控系统故障：阳性对照监控污染：阴性对照/基因组对照校准生物学误差：看家基因降低其余误差：重复实验,结果分析-绝对曲线,Color2-VICdetectionforGAPDH,Color1FAMdetectionforERBB2,结果分析-单双通道相互验证,ERBB2单双通道相互验证的实验结果,结果分析-扩增曲线,样品扩增：正常vs肿瘤,PMT1-FAMdetection-ERBB2,PMT2-VICdetection-GAPDH,肿瘤,肿瘤,正常,HealthyRNA,TumorRNA,GAPDH,ERBB2,10951052,21302492,9550085730,136000130800,Copiesng/lTotalRNA,ERBB2copies/GAPDHcopies,1095/95500=0.0111052/85730=0.012,2130/136000=0.0172492/130800=0.0197,HealthyRNA,TumorRNA,0.011,0.01