植物生理学实验课件6叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量测定_第1页
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实验6叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定一、实验目的和要求：掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。二、实验内容和原理：以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下：,1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。,+2KOH,+2KOH+CH3OH+C20H39OH,2、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。,？,？,3、取代反应。在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg+可依次被H+和Cu+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。H+取代Mg2+,Cu2+(Zn2+)取代H+。,褐色,绿色,4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。,透射光下呈绿色,反射光下呈红色,5、定量分析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。,a,b,Relativeabsorbtance,Waverlength(nm),三、主要仪器设备：1、天平（万分之一）、可扫描分光光度计（）、离心机2、研具、各种容（量）器、洒精灯等四、操作方法与实验步骤：,1定性分析：鲜叶5g+95%30ml（逐步加入）,磨成匀浆,过滤入三角瓶中,观察荧光现象透射光色，反射光光。,皂化反应(3ml)加KOH数片剧烈摇均，加石油醚5ml和H2O1ml分层后观察上层呈色，为，吸收光。下层呈色。为。吸收光。,取代反应（1）加醋酸约2ml，变褐（叶绿素）取1/2加醋酸铜粉加热变色，为叶绿素。,取代反应（2）：鲜叶2-3cm2，加Ac-AcCu20ml加热。观察：min变为色的叶绿素，min后，变为色的叶绿素。,2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：,皂化反应的上层黄色石油醚溶液,反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐),在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰,（稀释470nmOD0.5-1）,（稀释663nmOD0.5-1）,3叶绿素定量分析：鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，各取0.2ml加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb和Chl总量的值。五、实验数据记录和处理Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69OD645Cb(mg/L)=22.9OD645-4.68OD663CT(mg/L)=Ca+Cb或OD6521000/34.5,Chla含量(mg/g.FW)=（Ca(mg/L)/1000）2/0.15/0.2Chlb含量(mg/g.FW)=（Cb(mg/L)/1000）2/0.15/0.2Chl总含量(mg/g.FW)=（CT(mg/L)/1000）2/0.15/0.2六、实验结果与分析1、吸收
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