DNA指纹图谱技术

.,loading,12%,16%,18%,21%,26%,42%,52%,52%,63%,78%,96%,100%,.,DNA指纹图谱技术在土壤微生物多样性研究中的应用,以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法,主要内容,一、核糖体RNA基因的介绍,目前在微生物分类学及菌种鉴定研究中最有用和最常用的分子是rRNA，rRNA约占细胞中RNA总量的75%80%。真核生物：5S、5.8S、18S、28S四种rRNA基因原核生物：5S、16S、23S三种rRNA基因其中16S、18SrRNA基因大小适中，不但含有高度保守的基因片段，而且在不同的菌株间也含有变异的核酸片段，因此其应用最为普遍。,一、核糖体RNA基因的介绍,分析时可利用恒定区序列设计引物，将16SrDNA进行PCR扩增，产生长度相同但序列有异的DNA片段混合物，然后利用可变区序列的差异对不同菌属、菌种的细菌进行分离。由于16SrDNA及18SrDNA的序列，每年都以很快的速度补充到GenBank中去，这使得能够比较方便地利用这一数据库进行微生物群体多样性的研究。,利用rDNA测量细菌进化和亲缘关系,一、核糖体RNA基因的介绍,首先，16SrDNA普遍存在于原核生物中，参与生物蛋白质的合成过程，并在生物进化的漫长历程中保持不变，是生物演变的时间钟。其次，在16SrDNA分子中，既含有高度保守区域，又有中度保守和高度变化的区域，适用于进化距离不同的各类细菌亲缘关系的研究。第三，16SrDNA的相对分子量大小适中，约1540个核苷酸，便于序列分析。,利用rDNA测量细菌进化和亲缘关系,利用rRNA基因序列研究微生物多样性可采用不同的策略，目前一般常用以下几种方法：,二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法,1、变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳2、单链构象多态性3、限制性片段长度多态性4、末端限制性片段长度多态性5、随机引物扩增多态性6、扩增rDNA限制性酶切片段分析。,变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）,二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法,原理,在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺，从正极到负极梯度递加，或是形成温度梯度，电泳中的DNA到达它的变性甲酰胺浓度或温度时，双链部分解开，造成泳动速度发生变化，从而达到分离效果。,1、变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）,二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法,步骤,（1）样品总DNA提取；（2）样品16S或18SrDNA片段的PCR扩增及纯化；（3）制取变性梯度聚丙烯酰胺凝胶；（4）染色；（5）样品的DGGE分析；（6）割胶测序。,.,DGGE,2、单链构象多态性（SSCP）,二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法,不同碱基序列的单链DNA分子构象不同，DNA片段变性成单链后受到凝胶分子筛不同作用力，最终使不同DNA片段得到分离。电泳结束后可以将不同的条带切下并测序，或采用特异性探针进行杂交，进而显示该特定微生物类群的动态变化。,3、限制性片段长度多态性（RFLP）,二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法,根据不同生物个体或种群之间DNA片段酶切位点有所差异的特点，利用限制性内切酶进行消化，产生长短、种类、数目不同的限制性片段，然后对这些特定DNA片段的限制性内切酶产物进行分析，根据特定的限制性酶谱图可对群落中的微生物加以区分。,3、限制性片段长度多态性（RFLP）,二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法,(1)选用rDNA的恒定区序列设计引物；(2)选择性扩增rDNA片断；(3)对扩增产物用适当的限制性内切酶进行酶切；(4)琼脂凝胶电泳分离产生限制性片断；(5)用所得到的指纹图谱进行分析，根据片段的大小以及标记片断种类和数量的不同，分析群落的结构及组成多样性。,4、末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）,二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法,此法与RFLP原理相同，只是在PCR引物的一端用荧光染料进行标记，这样使得限制片段长度多态性图谱更为简化，只需检测被标记的末端限制性片段，就可以分析复杂群落。,5、随机引物扩增多态性DNA（RAPD）,二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法,对整个基因组的DNA分子而言，某一引物可能会与单链DNA的许多位点结合，然后对扩增产物进行电泳，用溴化乙锭染色，就可以直接检验出被扩增的DNA多态性。该技术以随机寡核苷酸作为引物，扩增得到的多态性片段较短，更方便检测两个同源或异源等位基因的有无，适用于种内和亚种更为细致的分类。,6、扩增rDNA限制性酶切片段分析（ARDRA）,二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法,ARDRA是用特定引物进行rDNA的扩增，再对扩增产物进行RFLP分析，这项技术可以为土壤细菌群落水平上提供可靠的基因型特征，这项技术常被用来了解各种样品的群落结构。ARDRA方法最大的缺点是工作量大，目前，应用该方法进行微生物群落结构分析，还没有人设置重复。,二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法,除此以外，还有重复基因外回文序列-PCR