PCR扩增原理及过程

第八章：聚合酶链反应技术及其应用。聚合酶链反应技术是一种在体内模拟脱氧核糖核酸复制并在体外选择性扩增脱氧核糖核酸特定区域的技术。这个过程有三个步骤，即普通的DNA复制。首先，模板DNA从双链状态变性为单链状态。然后引物与模板结合完成复制过程；最后，与模板互补的DNA在DNA聚合酶和底物的存在下合成。第一节聚合酶链反应技术原理和工作方法1。聚合酶链反应的基本原理1。基本要素和扩增原理DNA复制是生命活动中最基本的过程之一。聚合酶链反应的基本原理不能与DNA复制的基本规律分开。在聚合酶链反应过程中，模板可以是双链或单链，最后扩增的模板是双链状态。引物在DNA复制中是不可或缺的。与简单的DNA复制不同，PCR扩增总是在两个引物存在的情况下同时复制两条DNA，复制的结果是一条双链DNA。通过仪器的自动控制，这种DNA复制被重复以在两个引物之间获得大量的DNA片段，即靶片段。从上一轮扩增中获得的DNA产物可以用作下一轮扩增的模板，并且扩增产物以几何级数增加。在聚合酶链反应扩增步骤中，模板DNA首先在92-96度变性，使得双链DNA在高温下熔化成单链DNA。此时的温度称为熔化温度Tm，热变性不会改变其化学性质。染色后退火，降温至37-72度，将引物结合到模板的互补区，最后在72度下用DNA聚合酶连续向引物的3羟基末端加入脱氧核糖核酸，合成DNA。这一步称为扩展。这三个热反应过程的重复性称为一个循环。经过2040个循环后，位于两个引物序列之间的大量DNA片段可以被扩增。50%脱氧核糖核酸：50%脱氧核糖核酸分子变性的温度称为熔解温度/熔解温度。在正常生理条件下，Tm在85至95之间。影响Tm值的因素有：(1)随着Tm值的增加，溶液的离子强度增加，Tm值增加(离子键的形成增加)；当甲酰胺浓度增加时，Tm降低(碱基对之间的氢键不稳定，这可以防止高G和C含量的DNA在高温变性过程中断裂和失活)；如果DNA组成相对单一，变性发生在狭窄的温度范围内。2.聚合酶链反应系统。聚合酶链反应只能在特定条件下完成。只有当这些条件协调时，才能取得好的结果。1.缓冲液2，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)3，引物4，模板5，DNA聚合酶，1。缓冲液：除了提供酸碱度缓冲能力，缓冲液也有一些成分协助反应，主要是Mg2。Mg2的浓度将影响扩增的特异性和产量，并直接影响扩增的成败。对于不同的引物对和模板，镁离子的最佳浓度不同。为了确定最佳浓度，可以通过将Mg2的浓度增加到0.1-5摩尔/升来进行初步实验，以选择Mg2的最佳浓度。2.脱氧核苷三磷酸(dNTP)脱氧核苷三磷酸是合成脱氧核糖核酸的底物，高浓度的dNTP容易引起错误掺入；然而，如果浓度太低，反应产物的产率将会降低。四个脱氧三磷酸核苷酸的浓度应该相同。如果它们中的任何一个的浓度明显不同于其它的(更高或更低)，它将诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度并过早终止延伸反应。最终浓度为200M的脱氧核糖核酸通常用于聚合酶链反应。3.模板是要复制的核酸片段的脱氧核糖核酸或核糖核酸。因此，模板是聚合酶链反应的关键。模板的质量是聚合酶链反应成功的前提。通常，需要高纯度。最好使用纯化的DNA样品(粗产品应不含蛋白酶和核酸酶)。此外，模板的数量也会直接影响放大效果。一般来说，内容需要应用TaqDNA聚合酶被认为是一种低保真度聚合酶，因为它缺乏3至5核酸外切酶(校正)活性，但产量高，是目前实验室中使用最广泛的酶。使用具有3-5个核酸外切酶活性的耐热聚合酶可以提高保真度。然而，这些聚合酶的产量低于TaqDNA聚合酶。(1)TaqDNA聚合酶是目前实验室聚合酶链反应中最广泛使用的酶。它具有5至3合成活性和5至3核酸外切酶活性，但没有3至5核酸外切酶活性。95度的半衰期是40分钟。由于没有3至5核酸外切酶活性，扩增中的错配率为8.910-5 1.110-4。(2)来自嗜热细菌HB8的TthDNA聚合酶在74度扩增。在镁的存在下，以脱氧核糖核酸为模板合成脱氧核糖核酸，在氯化锰的存在下，以核糖核酸为模板合成脱氧核糖核酸。(3)脱氧核糖核酸聚合酶(4)脱氧核糖核酸聚合酶是一种具有3至5核酸外切酶活性的聚合酶，而高保真度(5)脱氧核糖核酸聚合酶是目前最广泛使用的具有3至5核酸外切酶活性的商业混合聚合酶。在这节课中，我们应该掌握以下问题。1.简述聚合酶链反应的工作原理。这是一种酶促反应，依赖于模板DNA、引物和脱氧核糖核酸聚合酶的存在。在一对引物的介导下，双链DNA通过温度调节变性为单链DNA，单链DNA可以与引物复性(退火)形成引物-DNA单链复合物，在dNTP的存在下，DNA聚合酶可以使引物沿着单链模板延伸成为双链DNA(引物的延伸)；这种热变性-复性-延伸过程是一个聚合酶链反应循环。有更多的周期更好吗？为什么？显然不是，一切都必须有学位。一般来说，25-30个循环后循环次数的进一步增加并不一定意味着产物的数量一定会增加，因为在聚合酶链反应扩增的中后期阶段存在平台效应。在此期间，产品的积累以减弱的指数速度增长。此时，也将出现一些不利因素：例如，底物和引物的浓度降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，生成的焦磷酸将产生对终产物的抑制，非特异性产物或引物的二聚体将产生非特异性竞争，扩增产物的自身复性，以及高浓度扩增产物的变性不完全。3.设计聚合酶链反应引物时应注意哪些原则？(1)长度：16-30bp，一对引物。太短-非特异性扩增增加，竞争和抑制特异性扩增，从而降低扩增的灵敏度；过长-容易形成稳定的杂交或链内互补，使引物延伸温度超过Taq酶的最适温度，同时增加检测成本。(2)碳含量：40-60%，Tm值在55以上。太低的气相色谱含量导致引物的Tm值较低，低退火温度不利于提高聚合酶链反应的特异性。过高的气相色谱含量也容易引发非特异性扩增。(3)碱基的随机分布：引物中四个碱基的分布