外源基因的原核表达.ppt

2020年6月1日星期一，1，外源基因的原核表达，2020年6月1日星期一，2，外源基因表达的作用：外源基因表达在重建目的基因和表达载体后，导入适当的受体细胞，在其中有效表达，产生目的基因产物。 外源基因的表达是研究和探索基因功能、基因表达调控机制、蛋白质结构和功能的重要方法，也是制备和生产新蛋白质药物不可或缺的手段。 外源基因的表达可以从宿主细胞中产生大量的目标蛋白质。 2020年6月1日星期一，3，常用的原核外源表达系统，大肠杆菌表达系统，芽孢杆菌表达系统，链球菌表达系统，蓝藻表达系统，2020年6月1日星期一，4，原核生物基因表达系统的特点： 1，原核生物多为单细胞异养，生长快，代谢康2、基因组结构简单，易于基因操作和分析。 3、多个原核生物细胞含有质粒和噬菌体，易于构建相应的表达载体。 2020年6月1日星期一，5，原核生物基因表达系统特点：4，无真核生物蛋白加工系统，表达产物无特定空间结构。 5、内源蛋白酶分解表达的外源蛋白，导致表达产物不稳定。 综上所述，近年来真核生物表达系统发展迅速，构建了相应的基因表达载体。 2020年6月1日星期一，6、大肠杆菌表达系统、大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最快、应用最广泛的经典表达系统。 属于革兰氏阴性细菌。 其特点是，基因背景清晰，目的基因表达水平高，培养时间短，2020年6月1日星期一，7，大肠杆菌表达系统主要不足，1，真核生物蛋白质翻译后修饰和加工过程不足。 2、表达的蛋白质多以包含身体的形式存在，需要重现性，能够恢复构象和活性3、宿主本身的杂蛋白质多，精制程序复杂。 2020年6月1日星期一，8，大肠杆菌基因表达载体，理想大肠杆菌表达载体特征，1，稳定的遗传和复制能力，无选择压力保存在大肠杆菌细胞内，2，显性转化筛选标志物，3，转录可以控制，抑制时背景转录水平低，4， 转录的mRNA可在适当位置终止，转录不影响载体转录5，具有外源基因插入适宜的酶切位点，2020年6月1日星期一，9，大肠杆菌基因表达载体组成，1，复制因子：包括起始位点和转基因作用区的DNA片段。 其功能是通过复制使载体在大肠杆菌细胞中稳定存在。 2020年6月1日星期一，10，大肠杆菌基因表达载体，2，筛选标志物：大肠杆菌转化后，只有少数细菌获得具有外源基因的质粒，能够稳定地继代，筛选标志物能够有效筛选外源基因转化的阳性重组2020年6月1日星期一，11，大肠杆菌基因表达载体，3，启动子：结合DNA依赖RNA聚合酶的DNA序列。 启动子是调控外源基因转录的重要顺应因素，与mRNA的合成有很大关系，是表达载体不可缺少的因素。 2020年6月1日星期一，12日，大肠杆菌基因表达载体，4，终结者：转录中可在特异部位停止转录的DNA序列。 有两种类型1、因子型终结者2、转录产物二级结构，2020年6月1日星期一、13、2020年6月1日星期一、14、大肠杆菌基因表达载体4、终结者：可在特异部位终止转录的DNA序列。 终结器有两种类型1、-因子2、转录产物的二级结构，2020年6月1日星期一、15、2020年6月1日星期一、16、2020年6月1日星期一、17、终结器功能(1)、目标基因mRNA长度可以有效控制(2)、mRNA稳定避免载体上其他基因异常表达，2020年6月1日星期一，18，大肠杆菌基因表达载体，5，核糖体结合位点：原核细胞mRNA蛋白合成起点上游的非编码序列。可以特异性结合30S小子单元中16 srrn-a 3末端的序列。 该序列富于嘌呤，核心序列为SD序列。 2020年6月1日星期一，19，大肠杆菌基因表达载体，6，密码子：密码子具有简并性，多个密码子编码为一个氨基酸，不同生物利用这些密码子的频率不同，不同密码子影响大肠杆菌的翻译速度。 2020年6月1日星期一，20，基因表达机制、基因工程技术的核心是基因表达技术。 迄今为止，构建了各种类型的表现系统，可以根据需要合理选择合适的表现系统。 外源基因在受体细胞中的表达，1、转录2、翻译2个环节，2020年6月1日星期一，21，基因表达机制，基因工程核心问题：有效表达外源基因的关键步骤：转录开始速度限制步骤：构建转录开始速度表达系统应首先考虑的问题是可控启动子2，相关可控序列2020年6月1日至22日，目的：在细胞生长初期不表达或表达于较低水平，细胞增殖至一定密度后，受某些诱导因子诱导启动转录合成mRNA。 2020年6月1日星期一、23日，mRNA延伸和稳定性：有效表达的关键是mRNA 1、有效延伸2、正确终止3、mRNA在细胞中的稳定存在，2020年6月1日星期一、24日，mRNA有效延伸：可能导致mrna转录早期终止的原因和解决方案1、衰减子：简单终止构建表达载体时，应避免该序列的存在。 2020年6月1日星期一、25、2，防止非特异性终止的方法是在构建表达载体时添加抗终止的序列元素。 2020年6月1日至26日，准确完成转录也是外源基因有效表达的重要因素，可防止不必要转录产物的产生，将mRNA长度限制在一定范围内，提高外源基因表达的稳定性。 原核生物的解决方案，真核生物的解决方案，2020年6月1日星期一，27日，mRNA在细胞中的稳定存在： mRNA在受体细胞中的稳定存在直接决定翻译产物的量。 解决办法1、原核生物：选择缺失RNase的工程菌株。 2、真核生物：提高mRNA的正确加工，2020年6月1日星期一，28，为有效翻译外源基因mRNA，有效翻译外源基因，构建表达体系时，1、AUG为优先起始密码子，2、SD序列为与核糖体的结合部位，3、SD序列与起始密码子的距离为39碱基4 翻译开始区周围的序列不易形成明显的二级结构，5、选择适当的终止密码子，2020年6月1日至29日，表达蛋白质在细胞中的稳定性，常用措施包括： 1、构建融合蛋白表达系统，2、构建分泌蛋白表达系统，3、构建封入体表达系统，4、 蛋白质水解酶基因缺陷受体系统的选择，2020年6月1日星期一，30外源基因在大肠杆菌中的表达产物位于细胞位置：外源基因在大肠杆菌中的表达产物可能存在于细胞质、细胞周质和细胞外培养基中。 其表达形式包括：形成： 1、不溶性蛋白质2、可溶性蛋白质、2020年6月1日星期一、31、大肠杆菌载体表达方式、非融合表达载体、融合表达载体、纯化标签表达载体、分泌型表达载体、表面表达载体、分子伴侣表达载体、2020年6月1日、32、1、 非融合表达载体：利用该载体表达的蛋白质与天然存在的蛋白质在结构、功能、免疫原性等方面基本完全一致。 目前市售的细胞因子类产品多采用这种表达载体。 2、融合表达载体：分子量小的蛋白质常在这样的载体中表达。 外源蛋白基因与受体菌本身的蛋白基因相结合，但两种基因的阅读框架没有改变。 2020年6月1日星期一，33，进行融合表达时，一般受体菌蛋白位于n末端，外源蛋白位于c末端。外源蛋白和菌体自身蛋白作为融合蛋白表达后，其稳定性大幅增加。 其原因是外源性小分子蛋白质上的酶切部位在分子表面露出。 以融合蛋白的形式表达，外源蛋白的部分在菌体自身蛋白的诱导下被正确折叠，可以最大限度地封闭酶切部位。 2020年6月1日星期一，34，带纯化标签的表达载体：载体有特殊序列，该序列表达后可作为纯化标签。 目的基因与该序列融合表达后，用亲和色谱法简单分离目的蛋白质，切除标签序列可获得纯化的目的蛋白质。 2020年6月1日星期一，35，分泌型表达载体：目的基因与信号肽融合表达，表达蛋白被信号肽诱导成为分泌蛋白。 表面表达载体：将目标基因克隆到细菌表面蛋白的结构基因中，达到细菌表面表达。 2020年6月1日星期一、36、2020年6月1日星期一、37、2020年6月1日星期一、38、2020年6月1日星期一、39、宿主菌、大肠杆菌表达系表达基因一般为异源基因，也是真核生物基因，是细胞内积累的大量异源菌重组异源蛋白在大肠杆菌中变得不稳定的原因是1、大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统，2020年6月1日星期一，40，2、大肠杆菌不具有真核细胞那样的亚细胞结构和表达产物稳定因子，3、大量异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中具有高浓度基于以上理由，为了有效表达外源基因，必须构建作为基因表达受体菌的工程菌株。 2020年6月1日星期一，41，常见大肠杆菌表达系统，Lac和Tac表达系统：以Lac操纵子控制机制为基础设计和构建的表达系统。 通过诱导大肠杆菌tacI基因突变，获得了能过量表达lacI抑制蛋白的基因突变体lacIq，将外源基因的表达控制在一定水平。 目前构建了蛋白质温敏突变体lacIq(ts )宿主菌和载体，控制lac和tac启动子的转录，在低温(30oC )下抑制基因转录，在(42oC )下释放基因转录。 2020年6月1日星期一，42、常见大肠杆菌表达系统、PL和PR启动子表达系统：由噬菌体早期转录启动子PL和PR构建。 对于野生型噬菌体，根据有无PL和PR启动子的转录，决定噬菌体进入开裂循环或溶解原循环。 噬菌体PE启动子调控的cl基因表达产物是PL和PR启动子转录的阻碍物，其表达和细胞中浓度依赖于一系列宿主和噬菌体因子的复杂平衡关系。 由于细胞因子调节cl在细胞中含量的途径操作困难，构建表达系统时应用温敏突变体cl1857(ts )的基因产物调控PL和PR启动子的转录。 2020年6月1日星期一，43，常见大肠杆菌表达系统，T7表达系统：利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统构建的具有高表达能力的表达系统。 T7噬菌体RNA聚合酶可选择性激活T7噬菌体启动子的转录，这是活性较高的RNA聚合酶，合成其mRNA的速度相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。 在大肠杆菌宿主细胞中，受T7噬菌体启动子控制的基因在T7噬菌体RNA聚合酶的存在下高表达。 2020年6月1日星期一，44、常见大肠杆菌基因表达受体菌株、菌株基因型启动子、BL21hsdSgalT7噬菌体、HMS174recA1hsdRrifT7噬菌体、M5279lacZtrpArpsL噬菌体RB791W3110lacIqL8lac、tac、2020年6月1日星期一45、大肠杆菌高效表达目标基因策略、表达相关因素优化、稀有密码子tRNA表达作用提高、外源基因表达产物稳定性提高、发酵过程优化、外源基因mRNA稳定性提高、2020年6月1日月具体方法是将强启动子和强终结子组合，在SD序列中增加与核糖体16SrRNA互补的碱基序列，调整SD序列和开始代码ATG间的距离和碱基的种类，防止核糖体结合部位附近的序列转录，形成卡发行结构。 2020年6月1日至47日，为优化和构建表达质粒，首先要考虑将目标基因翻译起始代码ATG与SD序列之间的距离和碱基组成控制在适当的范围内。 核糖体结合位点的序列变化对mRNA的翻译效率有显着影响，具体而言，SD序列AAGGA的翻译效率比AAGGA高36倍，翻译开始密码ATG与AAGGA的最佳距离为68碱长，与AAGGA的最佳距离为57碱长ATG与AAGGA至少与AAGGA至少相距5个碱基的mRNA的翻译，在ATG和SD序列之间的碱基组成为a，t碱基丰富的情况下，mRNA的翻译效率高。 研究表明，2020年6月1日至48日核糖体结合位点本身及邻近序列决定了靶基因mrna 5端的二级结构，mrna 5端形成的“茎环”结构阻碍了mrna与核糖体30S亚基的结合，抑制了翻译的开始。 尽可能提高核糖体结合部位本身及其附近序列中A/T碱的含量，降低mrna 5端形成的“茎环”结构的可能性也是构建表达质粒时应注意的事项。 必要时，定点突变、PCR等技术也可改变个别重要碱基破坏mrna 5端的“茎环”结构。 目的基因设计成多顺逆子结构，在大肠杆菌本身高效翻译起始因素后加入第二SD序列和目的基因，插入表达载体。 该方法通常适用于靶基因的5端序列易形成次级结构，不应改变其序列的情况，2020年6月1日星期一，49，表达质粒的优化和设计在构建表达质粒时，利用各基因的结构特征和特点，通过引入翻译增强子序列，实现mRNA的2020年6月1日至50日，提高稀有密码子tRNA的表达作用，简并密码子的使用频率差异与该tRNA在细胞中的存在度有关。 过度使用低丰度tRNA会导致tRNA枯竭而影响翻译。 使外源基因中的同义密码子发生点突变，作为受体菌常用密码子可以提高表达能力。 2020年6月1日至51日，大肠杆菌稀有密码子tRNA基因表达水平较高的基因具有较低表达水平的密码子偏好性。 目前所揭示的大肠杆菌的稀有密码子包括编码Arg的密码子AGA、AGG、CGA、CGG编码Pro的密码子CCC、CCU、CCA编码Cys的密码子UGU、UGC编码Gly的密码子GGA、GGG编码Leu的密码子CUC编码Ile的密码子AUA编码Ser的密码子UCA、A