生物化学-第四章-核酸杂交PPT课件

核酸分子杂交nucleicacidhybridization,第四章,.,2,本章内容,第一节核酸分子杂交的基本原理第二节核酸探针第三节印迹杂交技术第四节常用的核酸分子杂交技术,核酸分子杂交的基本原理,第一节,.,4,核酸变性核酸复性核酸杂交,.,5,在化学和物理因素的影响下,维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏,DNA双螺旋解旋成为单链的过程.DNA变性后，理化性质和生物活性丧失。,一、核酸的变性(denaturation),.,6,物理因素：热（高温）化学因素：酸、碱；变性剂（如尿素、胍）；有机溶剂（如乙醇、丙酮）,（一）引起核酸变性的因素：,.,7,（二）变性温度（或解链温度，Tm):,单链DNA的紫外吸收比双链DNA高40%，所以变性导致DNA的紫外吸收增加，称为增色效应（hyperchromiceffect）。,在热变性过程中，增色效应达一半时即双螺旋被解开一半时的温度称为解链温度(Tm)。,.,8,（1）碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)%（2）分子大小:（3）离子强度：（3）pH：59（4）变性剂：干扰碱基堆积力和氢键的形成，降低Tm值。,（三）影响Tm值的因素：,.,9,变性的DNA两条互补单链,在适当条件下重新缔合成双链的过程，又叫退火。,二、核酸的复性(renaturation),DNA复性后，理化性质和部分生物活性恢复。,.,10,复性导致DNA的紫外吸收降低，称为减色效应（hypochromiceffect）。,DNA的最适复性温度（Tor）比解链温度低20-25,.,11,（1）DNA大小：片段越小，复性越快；反之亦然。（2）离子强度：增加盐浓度可加速复性。（3）DNA浓度：浓度越大，复性越快。（4）若变性不彻底，复性很快。（5）序列越简单，复性越快。,影响复性速度的因素,.,12,DNA的变性和复性,.,13,三、核酸分子杂交(nucleicacidhybridization),在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。,.,14,杂交可以发生在DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA、以及人工合成的寡核苷酸单链与DNA或RNA之间。,分子基础：核酸的变性和复性,杂交可分为：液相杂交和固相杂交,.,15,液相杂交:进行杂交的核酸都在杂交液中特点:杂交速度快，但误差较高固相杂交:将参加反应的核酸先固定在固相支持物上，与杂交液中的游离探针进行杂交,.,16,复性,RNA,DNA,核酸分子杂交,第二节核酸探针,.,18,探针的概念探针的种类和选择探针的标记,.,19,一、探针(probe)的概念,一小段用染料(同位素、生物素或荧光)标记的(末端或全链)已知序列的多聚核苷酸，与固定在膜(NC、PVDF或尼龙）上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。简言之，探针指已知序列的标记核酸片段。,.,20,二、探针(probe)的种类,基因组DNA探针cDNA探针RNA探针人工合成的寡核苷酸探针（ASO）,.,21,基因组探针：用基因克隆技术分离获得的特异的DNA序列。RNA探针：特异DNA序列在体外转录出的RNA序列。cDNA探针：以特异mRNA序列为模板，在逆转录酶催化下合成的cDNA序列。寡核苷酸探针（ASO）：人工合成已知序列的寡核苷酸片段。,探针种类,.,22,三、探针的标记物,（一）放射性同位素标记物：32P、3H、35S,生物素（biotin）地高辛（digoxigenin）荧光素（fluorescein）酶（碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶）,（二）非放射性标记物：,.,23,四、探针的标记方法,酶标记法化学标记法,体外标记方法：,.,24,切口平移法（nicktranslation)随机引物法（randompriming）DNA的5末端标记PCR标记法,几种探针标记方法：,第三节,印迹杂交技术,.,26,印迹杂交技术以固相杂交为基础.,印迹杂交技术是将通过凝胶电泳分离的待测核酸转移并结合到固相支持物上，然后与探针进行杂交并分析。,印迹指将凝胶中的待测核酸转移到固相膜上。,.,27,一、固相支持物,硝酸纤维素膜尼龙膜活化滤纸,.,28,二、印迹方法,毛细管虹吸转移法真空转移法电转移法,.,29,三、印迹杂交过程,样品制备,电泳分离,预杂交,洗膜,分析,杂交,印迹,第四节,常用核酸分子杂交技术,.,31,DNA印迹法RNA印迹法斑点杂交法原位杂交,.,32,主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。,一、DNA印迹技术(Southernblotting),1975年,Southern印迹杂交（Southernblot）由英国人埃德温迈勒萨瑟恩（EdwinMellorSouthern）创建。,埃德温迈勒萨瑟恩,方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，通过显色，检测特定DNA分子的含量。,.,33,两个主要过程：一是印迹（blotting）二是分子杂交,主要步骤:RE酶切待测DNA琼脂糖电泳分离待测DNA片段使DNA变性中和预杂交杂交放射自显影结果分析,一、DNA印迹技术(Southernblotting),.,34,Southernblotting的步骤：,.,35,目录,.,36,放射自显影照片,.,37,将RNA样品完全变性，通过琼脂糖凝胶电泳按分子大小分离，然后转移到固相膜上，固定后与探针进行杂交。,二、RNA印迹技术(Northernblotting),用于RNA的定性定量分析。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，也可以比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。,.,38,Northernblotting的步骤,.,39,与DNA印迹的区别：DNA印迹是先电泳后变性、转移；RNA印迹是先变性后电泳、转移，且不能采用碱变性,.,40,三、斑点杂交法(dotblotting),特点:简单,但特异性差.,.,41,在细胞保持基本形态的情况下将探针注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在载物片上的细胞内进行。,四、原位杂交法(insituhybridization),.,42,DNA点阵,.,43,本章重点:,掌握以下概念:核酸分子杂交;探针;印迹；核酸的变性/复性