细胞培养-绪论PPT课件

.,1,细胞培养,.,2,第一章绪论,.,3,细胞是一切生命现象的基石和载体，事实上人体诸多的奥秘，包括生理的和病理的都是从细胞的活动中揭示出来。细胞的信息传递、代谢、增殖、遗传、变异、分化、疾病、衰老和死亡等无一不是整个机体生命过程的反映，甚至是缩影。细胞的发现和细胞学的创立是“十九世纪三大发现之一”；“每一个生物学问题的关键最终必然从细胞中去寻找”。研究细胞有多种方式、多条途径以及不同层次，但最重要的是对单个或群体细胞的观察与分析。其中细胞培养几乎可以最直接、最简单和最准确地反,.,4,映生命的各种活动规律，以及部分地提供在机体中发生的各种信息。细胞培养是一门技术，包含有诸多方面的知识，涉及细胞生物学、生物化学、分子生物学、动物学与植物学、病原学、遗传学、肿瘤学、生物工程学甚至光学、物理学等学科，因此学习细胞培养应有一定的其他学科的知识，操作时刻不忘“无菌”概念。,.,5,一、体外培养的概念体外培养技术是一门以模拟体内生长条件为基础而建立的“活体”实验技术。其相对于体内试验，具有能够简化细胞生长环境、明确生长条件、便于施加实验因素、容易获得活体直接观测结果以及方便控制培养产物等优点。,.,6,体外培养(invitroculture)：是将活体结构成分(如活体组织、活体细胞或活体器官等)甚或活的个体从体内或其寄生体内取出，模拟体内的生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下使之存活和生长发育的方法。按照体外培养的结构成分，可将体外培养人为分为：组织培养(tissueculture)细胞培养(cellculture)器官培养(organculture),.,7,组织培养:指从生物体内取出活的组织(多指组织块）在体外进行培养的方法。组织培养的对象在体外可以发生分化并保持组织的结构和功能，但不具备器官的结构和功能特点。细胞培养：指将活细胞(尤其是分散的细胞)在体外进行培养的方法。细胞培养强调在培养过程中分散的细胞不在形成组织。包括单细胞的培养、细胞克隆化培养。器官培养：指从生物体内取出活的器官(一般是胚胎器官)、器官的一部分在体外进行培养的方法。器官培养的对象在体外环境下也可能发生一定程度的分化，但始终保持器官的基本结构和功能特征。事实上，三种培养方法没有截然的界限。,.,8,.,9,组织培养过程中，培养组织不能在体外长期维持其结构和功能，培养的时间长，经过反复传代，细胞出现单一化现象趋向单一类型的细胞最终成为细胞培养。同样细胞在体外培养时也是相互依存的，而不是各自为政，表现为一定的“组织”特征，故组织培养和细胞培养实为同义词。是否有体内培养(invivoculture)？,.,10,体内培养(invivoculture)：将活体结构成分(如活体组织、活体细胞、活体器官等)甚至活的个体从体内或其寄生体内取出，放在其他生物体内让其生长和发育的方法。最常见的体内培养方式就是移植(trans-Plantation)。,.,11,二、体外培养技术的发展历史19世纪后叶实验胚胎学的兴起拉开了体外培养技术的序幕，一些著名实验如下：1859年，法国解剖学家Vulpain最早尝试将蛙胚尾部组织切下，放到普通水内进行“培养”，结果观察到了生长和分化现象。1885年，德国人Roux用温热的生理盐水在体外使鸡胚髓板组织存活了数天，被认为是体外培养的萌芽实验，他首次提出组织培养这一概念。1887年，Arnold将赤杨髓质小片在蛙的体液中浸过，然后将木片分别种植到蛙的皮下或腹腔内，木片被白细胞浸润后，于种植后不同时间将木片取出并置于温盐水中，观察到有白细胞从木片迁移到盐水中，且能短期存活。,.,12,1897年，Loeb首次在含有少量血浆凝块的试管中培养成年兔的肝、肾、甲状腺与卵巢植块，发现这些植块在3d内仍能保持正常的组织学结构。被认为是器官培养的最早尝试。1903年，Jolly用悬滴法将蝾螈的白细胞在体外维持存活了近一个月时间。1906年，Beebe和Ewing以盖片悬滴培养法用动物血清培养狗的淋巴肉瘤细胞在体外存活了约72h.,.,13,（一）体外培养技术的创立1907年，实验胚胎学家RHarrison在研究神经突起的起源时进行了一项著名的体外培养实验：实验对象：蛙胚髓管部的小片组织营养成分：蛙的淋巴液实验方法：盖玻片覆盖凹窝悬滴培养法实验结果：将蛙胚髓管部的小片组织在体外培养了数周之久，并观察到有神经突起从种植的神经组织块长出。贡献：Harrison的工作较为完善地建立了体外培养活体组织的培养体系，第一次较为系统地观察了体外培养活体组织的结果。被公认为是体外培养技术的开始，标志着体外培养技术的创立，标志着盖玻片悬滴培养法的建立，标志着神经组织体外培养的开始，也标志着神经突起是由神经细胞长出的这一重大理论的诞生。,.,14,.,15,1910年，ACarrel在没有抗生素的情况下，仅靠小心细致的无菌操作，连续培养鸡胚心脏植块长达数年之久。Carrel对体外培养的贡献：将无菌操作观念引入体外培养过程中。将培养组织包埋技术、营养供应以及继续培养(也称传代或继代培养)等许多重要的培养条件和方法引入盖玻片悬滴培养系统，从而完善了Harrison的方法。发现鸡胚浸液能明显地促进多种细胞的体外生长。设计卡氏培养瓶减少了污染，扩大了细胞生存空间。,.,16,1910年，美国医生MTBurrows对悬滴培养法的改进:用血浆凝块替代蛙淋巴凝块包埋要培养的组织，延长了组织在体外存活的时间。与Carrel合作，致力于发展哺乳动物组织的培养，证明体外培养细胞的寿命可以因传代而延长。胚胎浸液与血浆混合使用，培养物可以活的更好。通过Carrel等学者的工作，使得体外连续营养供应和传代成为可能。现在一般认为体外培养技术是从Harrison和Carrel真正开始的。,.,17,1925年，Maximov对悬滴培养法作了改进，创造了“双盖玻片法”，可以更好地防止污染，也更适用于神经组织的培养。两位美国科学家W.H.Lewis和M.R.Lewis最先试用已知成分的合成培养基取代不能准确确定其成分的天然培养基，由于他们和其它许多科学家在此后30多年的努力，最终发展出许多合成培养基。剑桥大学Strangeways实验室的HonorFell完善了组织和器官，乃至整个胚胎的体外培养方法(表玻皿器官培养法)。借此保持它们正常的组织学结构，并防止从外植物新长出的细胞生长紊乱。Fell及其同事使用此技术培养骨和关节组织，为我们提供了大量有关这些组织发育的知识。,.,18,（二）体外培养技术的发展发展主要包括：探讨体外培养的营养条件试图建立化学成分明确的人工合成培养基配方以代替成分不明确的天然物质。最终导致人工合成培养基的诞生。试图培养不同类别的生物体组织细胞1913年，Steinhard以血浆凝块悬滴培养法分离培养痘苗病毒，为体外培养技术在病毒学上的应用奠定了基础。1915年，Goldschmidt最早进行无脊椎动物组织的体外培养，成功培养了鳞翅目昆虫组织。建立不同的培养技术,.,19,发展时期：以20世纪50年代为界分为三个时期50年代前是培养技术在多个领域广泛发展的时期1933年，GOGey创立了旋转管培养法，并以此建立了许多细胞系。如1951年Gey等以肿瘤组织为材料成功建立了Hela细胞系。1948年，KKSanford创立了分离细胞培养法，第一次成功地从单层细胞分离出单个细胞，使得建立遗传性状相同的细胞株成为可能。1949年，Polge等发现了甘油能够用于保护低温下贮存的细胞。,.,20,50年代是培养技术迅猛发展时期，多种培养技术相继被建立1950年，JFMorgan等提出199配方。1951年，JEShannon和Earle建立T瓶（Earle瓶）培养法。CMPomerat改良和设计了结构简单且易于消毒的灌流小室，使得体外培养的细胞能在不断更新的培养液中生长。1954年，Earle等建立了悬浮培养法。1955年，HEagle等建立著名的Eagle培养基配方。1957年，Dulbecco等开始采用胰蛋白酶消化处理来分离细胞的方法以及应用液体培养基的方法，使得体外培养单层细胞成为可能。1959年，Lovelock等发现了一种新的化学冷冻保护剂-二甲基亚砜。1960年，GBarski等在两种不同类型的细胞混合培养物中，发现不同细胞间存在自发融合现象。,.,21,.,22,50年代后是体外培养技术与生命科学其它技术结合发展的新时期，诞生了多种培养的应用技术以体外培养技术为基础的应用杂交瘤技术制备单克隆抗体的技术、动物细胞大规模培养技术、微生物制药技术、基因转染与细胞融合以及细胞转化等细胞工程技术。1967年，ALVanWezel创立了微载体技术用于体外大规模培养。1972年，RAKnazek等创立了中空纤维细胞培养技术，模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的“毛细血管”中空纤维给体外培养的细胞提供物质代谢条件。标志着体外培养技术从过去以二维生长条件跨越到以三维生长条件进行体外培养的新阶段。,.,23,现代组织培养的三个阶段第一阶段悬滴培养悬滴培养法具有简便的特点，其次由于培养基中有纤维蛋白构成的支架，可供细胞向四面八方生长，培养物是立体的。在此环境中，细胞不仅能增殖生长，也能发生分化，如心肌发生搏动等。缺陷：空间狭小、气体不足、培养液少、难以大量繁殖细胞，观察不方便等。第二阶段单层培养单层细胞培养和体内细胞比仍然有很大差距(缺少细胞基质、血液供应、调控因子)。细胞只有长和宽二维结构，大多细胞会失去原体内时立体的形态，也是细胞生物学性状发生改变的主要原因。细胞在形态、功能上与体内时不同，多数不能充分表达原基因产物。第三阶段三维培养(立体培养)为培养细胞提供与体内相似的支架系统，创建与原体内类似的条件，不仅能促进细胞增殖，也可使细胞发生分化和表达体内时的某些产物。,.,24,现代组织培养的重要标志：培养液的改变培养容器的改变培养方法的改进：1948年Sanford创立了单细胞分离培养法1957年蛋白酶消化组织，分离细胞液体培养基的应用细胞培养用的多种材料都已商品化、规范化和系列化。低温冷冻技术的应用，可将已建立的多种细胞系和细胞株长期冻存。,.,25,细胞培养技术更加广泛地用于生物学和医学研究(如分子遗传学、分子生物学和细胞工程等学科均与细胞培养技术密切相关)如：应用理化因素诱发出遗传缺陷细胞株。利用细胞技术，用杂交瘤细胞制备McAb用细胞培养检测环境中可疑致癌物，癌基因转染和细胞转化等。基因工程的生产手段，用于生产多种生物制品。,.,26,（三）我国细胞培养技术的发展20世纪30年代细胞培养传入我国，50年代以后组织培养在我国逐渐开展起来。李继侗、沈同(银杏胚胎的培养)、罗宗洛和罗士伟(玉米根尖生长锥的培养)是植物组织培养的先驱者。细胞学家张钧、鲍鉴清和杨敷海等则最早将动物组织培养引入我国。病毒分离培养：汤飞凡、郭辉玉、顾方舟等昆虫组织培养：高尚荫、刘年翠等肿瘤培养：曾毅、鄂征、潘琼婧、何申、姚开泰等神经细胞培养：鲍璇、邵文钊、郭畹华等干细胞培养：姚鑫、吴祖泽等,.,27,三、体外培养技术的主要类别按照体外培养的对象，可分为全部培养和部分培养两大类：全部培养：指对生物个体进行培养。对象一般是微小的生物个体，如微生物、寄生虫等。部分培养：指对生物个体的一部分进行培养的技术。组织培养、器官培养、细胞培养,.,28,四、体外培养技术的应用在组织学与胚胎学上的应用：培养胚胎器官，研究其分化和发育过程。是研究胚胎发生、发育过程中诱导现象、发育潜能、胚胎致畸作用、环境诱变等衍生、演化生长行为及其机制的重要手段。在细胞生物学上的应用：广泛由于细胞形态学、细胞生理、细胞遗传学研究。肿瘤学方面的研究：肿瘤细胞生物学特性研究肿瘤发病机制研究异种移植研究,.,29,在微生物学领域的应用：病毒学、细菌学在免疫学方面的应用：抗体的产生、单克隆抗体的制备在药理学领域的应用：药物筛选、细胞毒性和活性检测动物细胞与微生物大规模培养技术在生产实践上的应用：疫苗、单克隆抗体、干扰素、激素、生长因子、酶制剂等在现代医学领域的应用：以培养细胞移植修复骨和软骨缺损、体外受精产生试管婴儿、转基因动物、干细胞移植、器官移植等。,.,30,五、对体外培养技术的评价能长时间直接观察活细胞的形态结构和功能活动，是多学科进行科学研究的对象和工具，如细胞学、遗传学、免疫学和肿瘤学等。供研究的细胞种类极为广泛，从低等生物到人，或正常组织或肿瘤组织细胞，而且便于记录(通过摄影、闭路电视和摄电影等方式)易施加理化因素和生物因素进行实验研究。如研究某种实验因素对细胞的生物学作用，只需在培养液中有针对性地加入或删除该成分即可。,.,31,可同时方便获得大量细胞类型单一、细胞周期同步、生物学性状基本相同并对实验因素反应一致的细胞群。能够进行大规模生物制品的生产。利用体外培养技术可以大量繁殖动物细胞或微生物以生产生物制品。与体内环境相比，体外培养细胞在一定程度上失去了组织联系及相互作用，缺乏在体内时的血运和神经体液调节作用，因此不能将体外实验结果一并推至体内，即不能轻易下结论。,.,32,1.Anchorage-dependentcellsorcultures(贴壁依赖性细胞或培养物)：体外培养的细胞只有贴附在不起化学作用的物体的表面时才能生长、生存或维持功能。2.Apoptosis(细胞凋亡)：是指细胞内死亡程序的启动而导致细胞自杀的过程，因此也常称为程序性细胞死亡(programmedcelldeath)。细胞凋亡与机体正常发育、形态形成以及多余细胞的清除等生理过程密切相关，所以被认为是一种积极的生理性死亡。,六、组织培养常用术语,.,33,3.Cellculture(细胞培养)：细胞在体外条件下的生长。4.Cellfusion(细胞融合)：体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使同种或不同种的2个或2个以上体细胞融合产生杂交细胞的过程。5.cellgenerationtime(细胞一代时间)：是指单个细胞两次连续分裂的时间间隔。可借助显微镜电影照相术来精确确定。6.Primaryculture（原代培养）：是指直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。,.,34,7.cellline(细胞系)：原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系。8.Clone(克隆)：单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。9.Confluence(汇合)：指在细胞培养瓶中培养的细胞彼此汇合形成单层，注意与细胞融合的区别。,.,35,10.Contactinhibition(接触抑制)：当一个贴壁生长的体外正常细胞生长至与另一个细胞相互接触时，便停止了分裂增殖，相互虽然紧密接触，但不形成交叉重叠生长，也不再进入S期。11.Invitromalignanttransformation(体外恶性转化)：细胞在体外培养过程中获得了致瘤性，当把这种细胞接种于适当的动物，可以产生肿瘤，即异种动物接种致瘤实验。12.Invitrotransformation(体外转化)：细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、抗原、增殖或其他特性的可遗传的变化，但不一定具有致瘤性。,.,36,13.Minimalmedium(最低限度培养基)：能满足大多数细胞生长增殖需要的最简单的培养基。14.Organculture(器官培养)：是指维持整个器官或器官的一部分在体外生存和生长，并一定程度上保持原来的结构和功能的方法。15.Passage(Subculture，传代或传代培养)：将细胞从一个培养瓶转移到更多培养瓶的过程。,.,37,16.Saturationdensity(饱和密度)：在特定条件下，培养容器能达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停止增殖。在贴壁培养中以每平方厘米的细胞数表示，而悬浮生长的细胞则以每立方厘米的细胞数表示。17.HeLacell来源于子宫颈癌组织(美国黑人妇女HenriettaLacks)的上皮细胞系，为体外最早建立的人类癌细胞系。,.,38,1951年，美国非裔烟农HenriettaLacks因宫颈癌病逝于巴尔的摩一家医院，当时她只有31岁。在未告知的情况下，科学家以她的子宫颈癌切除组织，成功培育出第1种体外可无限增殖的人类细胞系。很快“海拉细胞”(HeLacells)细胞就开始从巴尔的摩运往世界各地。62年过去了-这是拉克斯女士寿命的两倍-她的细胞承担了超过74,000项研究课题，其中很多已在细胞生物学、疫苗、试管婴儿、癌症研究和许多药物等方面结出了硕果，造就了产值庞大的相关产业。HeLa细胞是科学史上最著名且最有价值的人类细胞，不过未来取得“海拉细胞”的难度会提高。,.,39,.,40,.,41,拉克斯女士身后留下的孩子，现在已有孙辈和曾孙辈，他们中很多人还生活在巴尔的摩或附近地区。设在德国的欧洲分子生物学实验室(EuropeanMolecularBiologyLaboratory)的科学家今年3月发布了HeLa细胞系一个支系的全基因组序列，可供公开下载。包括会暴露出拉克斯后代的某些特征。这类信息可能会透露疾病倾向，像是酗酒、阿兹海默症或是躁郁症，并可能会使个人遭到保险公司拒保寿险或失能保险。在拉克斯家属提出抗议后，这些资料已不再“公诸于世”。,.,42,另一项由美国国家卫生研究院(NIH)资助、华盛顿大学(UniversityofWashington)进行的研究即将在nature上发表。这两项研究都未曾让拉克斯家庭知悉。美国国家卫生研究院的官员现在承认，研究院在最初申请资金对海拉细胞基因组测序时，就应该联系拉克斯家族。而在拉克斯家族提出反对后，他们也没有及时处理该问题。欧洲研究者们撤下此前发布的公共数据，华盛顿大学的论文发表也被叫停。柯林斯以及美国国家卫生研究院负责科学、普及和政策副主任凯茜L哈德逊(KathyL.Hudson)三次前往巴尔的摩与拉克斯的家人见面，并就研究和接下来应该怎么办进行了讨论。,.,43,这起事件引发拉克斯家族与NIH对话，8月8日NIH宣布，已和HenriettaLacks的后代达成协议：两项研究所得出的数据应该被储存在该研究院的基因型和表型数据库，想要使用数据的研究者可以进行申请，获得权限，而且必须每年提交研究报告。NIH一个被称为“海拉基因组数据权限获取工作小组”的组织会对这些申请进行审查，小组中将有拉克斯的两名家族成员。根据协议，拉克斯家族不会获得海拉基因组研究所产生的任何可能商业产品带来的利益。签订上述协议后，华盛顿大学的研究人员便可以发表其研究结果了。他们的分析在几个方面超过了欧洲的研究。最重要的是，他们精确地说明了海拉细胞DNA中每一个基因的具体位置。,.,44,即研究人员要使用HeLa细胞做研究，必须向NIH申请，并且遵守两名拉克斯家属参与的小组规范条款，并将研究成果贡献到资料库。NIH院长柯林斯(FrancisCollins)告诉记者：“这是具历史性的新协议。”这项协议将“保护家属权益，同时也加深他们对生物医学研究的投入”。,.,45,18.Suspensionculture(悬浮培养)：细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的一种培养方法。19.Tissueculture(组织培养)：组织在体外条件下保存或生长。借此组织结构或功能得以在体外保持，亦可能在体外维持其分化。20.Transfection(转染)：用生物学的、物理的或化学的方法将目的基因转移到培养细胞内的实验方法。21.Lipofectin：一种常用的细胞转染试剂，用该试剂包裹DNA可形成脂质体-DNA复合物，再通过细胞膜融合可将DNA转染入哺乳动物细胞。,.,46,22.Cellcycle：指细胞从前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程。分4个时期，即DNA合成期(S期)、有丝分裂期(M期)、有丝分裂完成至DNA合成开始的间隙期(G1期)以及DNA复制结束至有丝分裂开始的间隙期(G2)。若某种原因细胞不再沿细胞周期运行，而进入休眠状态称为G0期。,.,47,23.细胞株(cellstrain)：是由具有某些特性与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系，这些特性或标志在随后的培养中必须保持下去。,.,48,24.Stemcell(干细胞)：具有继续增殖与分化潜能的细胞，其中胚胎干细胞(Embryonicstemcell，ESC)可形成机体所有各种类型的组织和细胞，甚至发育成一个完整的胚胎，故又称全能性(totipotency)干细胞。随着细胞分化，这种分化潜能逐渐受到局限，只能分化形成有限细胞类型的细胞称为多能性(multipotency)干细胞，最终成为单能干细胞(Monopotencystemcell)或定向干细胞(directional).,.,49,克隆羊多利(Dolly)的诞生1997年2月，英国Roslin研究所克隆羊多利(Dolly)的诞生揭示一个全新概念：由成年机体的一个体细胞核，可以复制一个基因完全相同的新生命个体。克隆羊的诞生，预示着动