蛋白质的提取与纯化

蛋白质的提取与纯化1 .蛋白质的提取大多数蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液中，与脂质结合的蛋白质可溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此可使用不同的溶剂萃取分离纯化蛋白质和酶。(1)水溶液萃取法稀盐和缓冲系的水溶液对蛋白质稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质最常用的溶剂，通常使用原材料体积的15倍的量，提取时需要均匀搅拌，有利于蛋白质的溶解。 提取的温度取决于有效成分的性质。 另一方面，很多蛋白质的溶解度随温度升高而增大，温度升高时容易溶解，提取时间缩短。 但另一方面，温度升高时蛋白质变性失活，因此从这一点出发，提取蛋白质和酶时一般在低温(5度以下)下操作。 为避免蛋白质提取过程中的分解，可加入蛋白质水解酶抑制剂(二异丙基氟磷酸、碘乙酸等)。重点研究了提取液pH和盐浓度的选择。1、pH值蛋白质、酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。 用稀酸或稀碱提取时，应防止蛋白质解离性基因过酸或高碱而变化，蛋白质的构象发生不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质是用酸性提取液提取的，酸性蛋白质是用碱性提取液提取的。2、盐浓度稀浓度促进蛋白质的溶解，被称为盐溶作用。 同时稀盐溶液由于盐离子与蛋白质部分结合，具有蛋白质难以改性的优点，因此在提取液中添加少量的NaCl等中性盐，一般为0.15摩尔。 最好提高浓度。 缓冲液通常使用0.02-0.05M磷酸盐或碳酸盐等渗透盐溶液.(2)有机溶剂萃取法与脂质结合较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱，是乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂，具有一定亲水性，是强亲油性、理想的脂蛋白提取液。 必须在低温下操作。 丁醇提取法特别有利于提取与脂质紧密结合的蛋白质和酶。 一个是因为丁醇的亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强，第二个是因为丁醇兼有亲水性，在溶解度的范围内(度为10%，40度为6.6% )不会引起酶的变性失活。 另外，丁醇提取法pH和温度的选择范围广，也适用于动植物和微生物材料。二、蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化方法很多，主要有以下几种方法(1)基于蛋白质溶解度差异的分离方法1 .蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显着影响，一般在低盐浓度下，随着盐浓度的升高，蛋白质的溶解度增加，将其称为盐溶解，盐浓度持续上升时，蛋白质的溶解度降低，前后析出的现象称为盐析，在蛋白质溶液中加入大量的盐时， 高浓度的盐离子(硫酸铵的SO4和NH4等)具有很强的水合力，可以夺取蛋白质分子的水合层，使其“脱水”，蛋白质胶体粒子凝结沉淀析出。 盐析时溶液pH值在蛋白质等电点有效。 由于各种蛋白质分子粒子的大小、亲水度不同，盐析所需要的盐浓度也不同，调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度后，各种蛋白质逐步沉淀。影响盐析的因素除了(1)在低温(4度)下操作温度敏感的蛋白质以外，一般可以在室温下进行。 一般温度低的蛋白质溶解度降低。 但是，血红蛋白、肌红蛋白、白蛋白等蛋白质在高于0度的温度(25度)下溶解度低，容易盐析。 (2)pH值：大部分蛋白质在等电点下在浓盐溶液中的溶解度最低。 (3)蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，需要分离的蛋白质多与其他蛋白质一起沉淀(共沉淀现象)。 因此，盐析前在血清中加入等量生理盐水进行稀释，使蛋白质含量达到2.5-3.0%。蛋白质盐析常用的中性盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中使用最多的硫酸铵，温度系数小，溶解度大(25度饱和溶液为4.1M，767g/升； 0度饱和溶解度为3.9M，即676克/升，在该溶解度范围内，可盐析多种蛋白质和酶，硫酸铵的逐步盐析效果也优于其他盐，不易引起蛋白质改性。 硫酸铵溶液的pH通常在4.5-5.5之间，在其他pH下进行盐析时，用硫酸或氨水调节。蛋白质在盐析沉淀中分离后，需要去除蛋白质中的盐，透析即将蛋白质溶液放入优析袋中，用缓冲液透析，继续更换缓冲液的方法很普遍，因为透析需要花费时间，所以最好在低温下进行。 另外，通过葡萄糖凝胶G-25和G-50柱也可以除去盐，时间短。2、等电点沉淀法蛋白质在静电状态下粒子间的静电排斥力最小，溶解度也最小，各种蛋白质的等电点存在差异，可以调节溶液的pH达到某种蛋白质的等电点进行沉淀，但该方法很少单独使用，可与盐析法并用。3 .低温有机溶剂沉淀法在可与水混合的有机溶剂、甲醇、乙醇、丙酮中，可降低多种蛋白质的溶解度使其析出，该方法比盐析分辨率高，但蛋白质容易改性，因此应在低温下进行。(2)蛋白质分子大小不同的分离方法1、透析和超滤透析法用半透膜分离分子大小不同的蛋白质。超滤法利用高压力和离心力，使水和其他小溶质分子强力通过半透膜，将蛋白质残留在膜上，选择不同孔径的过滤膜捕捉不同分子量的蛋白质。2 .凝胶过滤法又称分子阻断色谱或分子筛色谱，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。 柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadex ged )和琼脂糖凝胶(agarose gel )。(3)根据蛋白质的带电特性进行分离；蛋白质根据pH环境的不同，带电性和电荷量也不同，可以分离。1 .电泳法各个蛋白质在相同的pH条件下，根据分子量和电荷量在电场中的迁移率不同而被分离。 值得注意的是等电聚焦电泳。 它以一种两性电解质为载体，电泳时两性电解质形成从正极向负极逐渐增加的pH梯度，带有一定电荷的蛋白质在其中迁移时，到达各自的等电点的pH位置停止，该方法可用于各种蛋白质的分析和制备。2 .离子交换色谱法作为离子交换剂，可列举阳离子交换剂(羧甲基纤维素； CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素； DEAE？ FONT FACE=宋体 LANG=ZH-CN 纤维素，分离的蛋白质溶液流过离子交换色谱柱后，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质吸附在离子交换剂上，之后通过改变pH和离子强度，吸附的蛋白质溶出。 (详见色谱技术章节)(4)基于配体特异性的分离方法亲和层析亲和色谱(aflinity chromatography )是分离蛋白质的极为有效的方法，常常可以将一步处理精制的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来。 该方法可以通过一种蛋白质与另一种被称为配体(Ligand )的分子特异且不共价键合来实现。 其基本原理：蛋白质在组织和细胞中作为复杂的混合物存在，每种细胞都含有数千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离、纯化(Purification )被进行和鉴定(Characterization )是生物化学的重要组成部分，因为可以以前所未有的单一或现有方式从复杂的混合蛋白质中提取任何蛋白质，所以通常并用几种方法。细胞破碎1、高速组织破碎：将材料制成薄糊状液，放置在缸内约1/3体积，关闭缸盖，将调速器转到最慢的位置，打开开关后慢慢加速至所需速度。 该方法适用于动物的内脏组织、植物肉质种子等。2、玻璃匀浆：先切好的组织放入管中，再放入研磨棒前后研磨，上下移动可粉碎细胞。 该方法细胞破碎度高于高速组织粉碎机，适用于少量动物器官组织。3、超声处理法：以一定功率超声处理细胞悬液，使细胞激震破裂的方法多用于微生物材料，用大肠杆菌(Escherichia coli ) (Escherichia coli ) (Escherichia coli )制备各种酶，常选择50100mg菌体/ml浓度， 1KG到10KG频率处理10-15分钟的方法缺点是处理过程中产生大量热量，应采取相应的降温措施。 对超声波敏感，核酸应慎重使用。4、反复冻融法：将细胞冻结在-20度以下，在室温下融解，反复数次，细胞内冰粒形成和剩馀细胞液盐浓度升高，溶胀，破碎细胞结构。5、化学处理法：某些动物细胞如肿瘤细胞可被十二烷基磺酸钠(SDS )、脱氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁(cellwall)(cellwall )较厚，经溶菌酶处理效果较好。无论用哪种方法破碎组织细胞，都可以将细胞内的蛋白质和核酸水解酶释放到溶液中，使高分子生物降解，减少天然物质的品质，加入二异丙基氟磷酸(DFP )后，通过加入能够抑制或减慢自溶作用的碘乙酸， 可以抑制活性中心需要疏基的蛋白水解酶的活性，通过加入甲磺酰氟(PMSF )可以消除蛋白水解的活力，但不是一切，而是通过选择pH、温度和离子强度等，可以使这些条件适应目标物质的提取。浓缩、干燥、保存一、样品浓缩生物高分子在制造过程中经柱精制后样品变稀薄，需要以保存和鉴定为目的进行浓缩。 一般浓缩方法的1、减压加温蒸发浓缩通过降低液面压力来降低液体沸点，减压真空度越高，液体沸点越低，蒸发越快，该方法越适用于无耐热性生物高分子的浓缩。2 .空气流动蒸发浓缩空气流动可以加速液体蒸发，铺在薄层溶液上，表面不断通过空气流动，或者将生物高分子溶液装入塑料袋内，用风扇吹风，达到不蒸发透过膜外的溶剂的浓缩目的的方法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩3 .冻结法生物高分子在低温下结冰，盐类和生物高分子不进入冰中而留在液相中，操作时将浓缩的溶液冷却成固体，然后慢慢熔化，利用溶剂和溶质的熔点差异，达到了除去大部分溶剂的目的。 用这种方法浓缩蛋白质和酶的盐溶液，可以使不含蛋白质和酶的纯冰晶体浮在液面上，蛋白质和酶集中在下层溶液中，去除上层冰，得到蛋白质和酶的浓缩液。4 .吸收法是用吸收剂直接吸收除去溶液中的溶液分子并浓缩。 使用的吸收剂与溶液没有化学反应，不吸附在生物高分子上，容易与溶液分离。 常用的吸收剂为聚乙二醇、聚乙基吡咯烷酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，首先将生物高分子溶液放入半透膜的袋中，用聚乙二醇复盖放置在4度以下时，袋内的溶剂渗出，迅速吸收到聚乙二醇中5、超滤法是一种采用特殊薄膜选择性过滤溶液中各种溶质分子的方法，液体在一定压力下(氮气压力或真空泵压力)通过膜，溶剂和小分子透过，保留大分子，是近年来发展起来的新方法，最适合生物大分子，特别是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，成本低，操作方便适用超滤法的关键在于膜的选择、种类和规格不同的膜、水的流速、分子量的截止值(即膜中大致保留分子量的最小值)等参数不同，必须根据工作的需要进行选择。 另外，在超滤装置的形式中，溶质成分、性质、溶液浓度等对超滤效果有一定的影响。 Diaflo超滤膜分子量陷阱值：用上述超滤膜制作中空纤维管，捆扎许多这样的管，在管的两端连接低离子强度的缓冲液，使缓冲液不断地流入管中。 透析纤维管浸泡在蛋白质溶液中。 缓冲液在纤维管中流动时，小分子容易透过膜扩散，不能形成大分子。 这是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，透析时间缩短了10倍。二、干燥生物大分子制备的产品，为了防止变质、易于保存，需要经常进行干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。 真空干燥不会升高温度，适用于易氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器和真空干燥原理，同时增加了温度因素。 在相同的压力下，水蒸气压随着温度的下降而下降，因此在低温低压下冰很容易升华为气体。 作业时，一般是在冰点下冷冻干燥的液体使其固体，在低温低压下使溶剂成为气体除去。 该方法干燥的产品具有松散、溶解度好、保持天然结构等优点，适合各种生物高分子的干燥保存。三、储藏生物高分子的稳定性与保存方法有很大关系。 干燥产品一般稳定，低温下几天至几年无活性变化，贮藏要求简单，将干燥样品放入干燥器内(干燥剂内置)密封，保持0度至4度冰箱即可。 贮存液体时要注意以下几点。1、样品不要太薄。 不浓缩到一定浓度，就不能包装贮藏。 样品过稀，生物高分子容易变性。2、一般需要加入防腐剂和稳定剂，常用防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、肉豆蔻醇等。 蛋白质和酶常用的稳定剂是硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，像酶一样可以加入基质和辅酶提高稳定性。 另外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定的保护作用。 核酸大分子一般保存在氯化钠和柠檬酸钠的标准缓冲液中。3 .贮藏温度要求低，多在0度左右的冰箱中保存，有时要求更低，必须由不同的物质决定。用适应蛋白质性质的方法可以分离蛋白质混合物1 .分子尺寸不同类型的蛋白质在分子大小上存在一定差异，可以用一些简便的方法初步分离蛋白质混合物。1.1透析和超滤透析常用于精制，去除盐类(脱盐及置换缓冲液)、有机溶剂、低分子量抑制剂等。 透析膜的捕集分子量为5000左右，例如分子量不足10000的酶液有泄漏的危险，在精制中非常常用，可以除去盐类、有机溶剂、低分子量的阻碍剂等。 超滤一般用于浓缩和脱色1.2离心分离置换缓冲液许多酶被浓缩到某个细胞器中，匀浆后得到某个亚细胞成分，使酶浓缩1020倍，精制出特定的酶。 差速离心分辨率低，只适用于粗提和浓缩。 速带法由于离心时间过长，所有物质都会沉淀，需要选择最佳的分离时间，可以得到相当纯粹的亚细胞成分进一步纯化，避免差速随心大小的成分沉淀的问题，但容量小，只能用于少量的制备。 等密度梯度离心常用的脱主介质有蔗糖、蔗糖、氯化