双酶切和同源重组方法构建pMIR_reporter载体的比较

： 论著 双酶切和同源重组方法构建 载体的比较 马凯， 胡红霞， 于婧， 周丹， 孙艳， 马磊， 沈波 （ 南京医科大学病原生物学系， 江苏南京 ） 【 摘要】 目的 以 为载体骨架， 通过双酶切方法和同源重组方法构建载体， 比较两种不同载体构建方法 的优缺点。 方法 双酶切方法使用 和 两种限制性内切酶分别酶切 和经克隆后靶基 因 片段， 形成带有相同粘性末端的线性载体片段和 片段， 然后利用 连接酶连接， 连接产物转化大肠 埃希菌感受态细胞， 转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性单克隆筛选并测序。同源重组方法利用同源 重组原理， 通过重组酶将靶基因 片段和经 酶切 线性载体重组连接， 连接产物转化入大肠埃 希菌感受态细胞中， 转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性克隆筛选并测序。 结果 从载体构建耗时、 总步骤数和阳性率三方面进行比较， 双酶切载体构建方法需要 个独立试验， 试验净耗时 ， 阳性率为 ； 同源重 组法需要 个独立试验， 试验净耗时 ， 阳性率为 。 结论 双酶切载体构建方法步骤繁琐。同源重组法步骤 相对简单， 可以高效快速地构建载体， 但是假阳性率略高。 【 关键词】 载体； 酶切； 连接； 同源重组 【 中图分类号】 【 文献标识码】 【 文章编号】 （ ） ； （） ： ， ， ， ， ， ， （ ， ， ， ） 【 】 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， 【 】 ； ； ； 基因克隆是分子生物学中的一种基本的操作方 法 。通过双酶切来构建载体是其中常用的一种方 法， 这种方法利用限制性内切酶可以识别并切割特定 的核苷酸的原理， 用两种不同的限制性内切酶切割靶 基因得到前后都带有粘性末端的靶基因片段， 与同样 经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的 线性载体在 连接酶作用下进行连接， 从而实 现基因克隆 。但是在实际操作中经常会遇到酶切 效率及连接效率不高等问题， 致使靶基因片段插入载 体相当困难， 为此人们采取了多种策略进行克隆。最 近开发了一种叫做同源重组的基因克隆方法， 相比双 酶切载体构建方法， 该方法的构建过程有些不同。首 先， 靶基因片段扩增引物有别于常规引物设计； 其次， 中 国 病 原 生 物 学 杂 志 年月 第 卷第期 ， ， 【 通讯作者】 沈波， ： 【 作者简介】 马凯（ ） ， 男， 陕西人， 硕士研究生。主要研 究方向： 媒介抗药性的分子基础。 ： 载体切割过程中只需要进行单酶切； 第三， 载体和目的 基因片段的连接是基于同源重组而不是粘性末端互 补 。在实际操作过程中， 双酶切方法和同源重组方 法各有优势， 现以 载体构建为例报道 如下。 材料与方法 材料 大肠埃希菌 购于天根公司； 质粒 由本实验室保存； 限制性内切酶 、 ， 连接酶， 同源重组酶， 凝胶回收试剂盒等 购自大连宝生物公司； 聚合酶购自诺唯赞 公； 质粒抽提试剂盒购于天根公司。 方法 引物设计 双酶切构建方法中使用的引物为 （ ） 和 （ ） 。 中 是 的酶切位点及相应的保护性碱 基， 中 是 的酶切位 点及相应的保护性碱基。同源重组方法使用的引物为 （ ） 和 （ ） 。 该 方 法 应 用 同源重组原理进行连接， 在同源重组中为了保证目的 片段插入载体的方向， 上、 下游引物的 端分别加入 及该酶切位点前后约 个碱基的载体序列。 扩增目的基因 提取羽化的淡色库蚊 雌蚊 ， 反转录 为 后 进 行 聚 合 链 式 反 应 （ ） 。反应体系： 上游引物， 下游引物， 模板， ， 。反应条件： ； ， ， ， 共 个循环， 。 产物 保存， 并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定和纯化。 克隆 纯化回收后的 产物尾部带着 尾， 而 载体尾端带着 尾， 因此利用碱基互 补原理将 产物插入 载体后测序。连接体系： ， ，插入片段， 总体系为 。连接体系置 反应 ， 连接 产物转化大肠埃希菌 ， 转化菌涂布含有氨苄青 霉素的固体培养基平板进行阳性单克隆筛选， 鉴 定正确的单克隆菌液送华大基因公司测序（ 图） 。 载体酶切 在双酶切构建载体的方法中， 用 和 限制性内切酶对 克隆载体和 载体切割。酶切体系： ， ， ， 克 隆载体， 总体系为 。酶切体系置 反应 （ 图 ） 。在同源重组构建载体的方法中， 用 限 制性内切酶对 载体切割。酶切体系： ， ， ， 总体 系为 。酶切体系置 反应 （ 图 ） 。 图 双酶切法载体构建简易流程图 图 同源重组法载体构建简易流程图 目的片段与 连接 在双酶切载 体构建方法中， 利用 线性载体和经 克隆酶切后的 产物两端的粘性末端， 用 连接酶把 产物连接入 。连 接体系： 插入目的片段， ， ， ， 总体系为 （ 图 ） 。在同源重组方法中将 产物重组入 。重组反应体系： ， 中 国 病 原 生 物 学 杂 志 年月 第 卷第期 ， ， ， ，目的片 段， ， 总体系为 。连接产物转化入 大肠埃希菌感受态细胞中， 转化菌涂布含氨苄青霉素 的固体培养基平板进行阳性克隆筛选并测序（ 图） 。 结 果 双酶切法载体构建 目的基因 的扩增 以淡色库蚊 为模板， 用酶切法特异引物扩增目的基因。琼脂糖 凝胶电泳显示扩增产物为 ， 与预期结果一致 （ 图 ） 。 标志物（ ） 基因 产物 图 基因 产物电泳鉴定 （ ） 克隆载体构建 基因 产物纯 化回收后插入到 ， 连接产物转化大肠埃希菌 感受态细胞， 转化菌菌液涂平板， 培养后进行单克隆筛 选的菌液 鉴定（ 图） ， 构建 成功， 测序显示 序列未发生突变。 标志物（ ） 转化菌菌液 产物 图 阳性克隆 鉴定 （ ） 克隆载体和 载体双酶切 克 隆 载 体 酶 切 及 纯 化 产 物 电 泳 结 果 见 图， 载体酶切结果见图。 载体与目的片段连接及鉴定 连接产物转化 感受态细胞， 转化菌涂布含氨苄 青霉素的固体培养基平板。挑 取 单 克 隆 进 行 菌 液 鉴定， 结果见图。测序显示载体构建成功。 同源重组法载体构建 目的基因 的扩增 以淡色库蚊 为模板， 用同源重组特异引物扩增目的基因。琼脂 糖凝胶电泳显示扩增产物为 ， 与预期结果一致 （ 图 ） 。 双酶切图 目的片段切割纯化产物 图 克隆载体酶切图及纯化图 载体双酶切（ 酶切产物） 纯化的线性 酶切产物（ 回收产物） 图 载体酶切及纯化图 （ ） （ ） ， 阳性克隆 阴性克隆 图 阳性克隆 鉴定 ， 载体单酶切及纯化 限 制性内切酶酶切 ， 酶切及纯化结果见 图 。 中 国 病 原 生 物 学 杂 志 年月 第 卷第期 ， ， 标志物（ ） 目的基因 产物 图 基因 产物电泳鉴定 载体 单酶切（ ， 酶切产物） 纯化回收的线性 酶切产物（ ， 目的基因回收产物） 图 载体单酶切及纯化回收产物鉴定 （： ；： ） （： ；： ） 载体与目的片段重组连接及鉴 定 重组连接产物转化 感受态细胞后涂布含氨 苄青霉素的固体培养基平板， 挑单克隆进行菌液 鉴定， 结果见图 。测序显示载体构建成功。 阴性克隆 阳性克隆 图 阳性克隆 鉴定 两种载体构建方法优缺点比较 双酶切载体构建法共 个独立试验， 耗时 （ 次测序） ， 阳性率为 ； 同源重组法共 个独立试 验， 耗时 （次测序） ， 阳性率为 。 讨 论 载体构建是分子生物学研究常用的手段之一 ， 整个过程包括目的基因扩增， 载体和目的基因酶切， 末 端间连接， 感受态细胞转化和阳性克隆的筛选， 每一个 步骤都必须严格控制其反应条件 。 双酶切构建载体方法比较繁琐。首先， 对引物的 设计有着严格的要求， 引物的长度一般为 ， 含量控制在 ， 上、 下游引物之间 含 量不能相差太大， 引物中需要加入酶切位点及保护性 碱基 。引物设计不当可能在扩增时生成引物二聚 体， 给实验带来不便。其次， 目的基因有必要进行 克隆。在后续的实验操作中， 可能会由于酶切效率 和连接效率低等原因使得载体构建相当困难， 目的基 因扩增在这些步骤之前， 由于 扩增是体外扩增， 很容 易 发 生 突 变， 克 隆 有 着 成 功 率 高 的 优 点 ， 通过 克隆将目的基因构建进 进而转化入大肠埃希菌中， 单克隆菌体自身的修复机 制可保证单一的克隆， 利于筛选需要的序列， 通过后续 测序鉴定可以得到大量正确的目的基因片段， 而且直 接将 产物切下不易产生粘性末端， 连接入表达载 体比较困难， 通过克隆酶切的目的片段产生粘性 末端的概率很高。第三， 双酶切效率不高。由于不同 的酶所对应的缓冲液不同， 内切酶只有在最适的缓冲 液环境下效率才能得到最优化， 但是双酶切体系势必 使其中一个酶的活性有所损失。本实验选用 和 这两种限制性内切酶， 其中 在 中活性最高， 而 在 中活性最高， 但 是当 和 处于一个体系时， 的活性 因共用 而降低， 这样必定会使酶切产物不 纯。酶切产物中既有单酶切线性载体， 也有双酶切线 性载体， 使得连接时所需要的双酶切线性载体的量失 准， 影响连接效率。因此可以先用一个限制性内切酶 切割， 纯化回收后再用另外一个限制性内切酶切割纯 化回收， 但工作量较大， 回收效率低。第四， 连接效率 低。 与目的片段的摩尔比很重要， 一 般在 间浮动， 而且连接效率和连接反应 体积也有关系。本实验在 、 不同的体系下 尝试以、 、 不同的摩尔比进行 连接， 最后在 ，摩尔比的体系下连接成功。 采用同源重组法构建载体与常规双酶切构建载体 方法不同。首先， 设计引物时上游引物 端前面加的 是 酶切位点及该酶切位点在 载体中对应前面的 个碱基载体片段， 下游引物 端 前面加的是 酶切位点及该酶切位点在 载体中对应后面的 个碱基载体片段， 如此 中 国 病 原 生 物 学 杂 志 年月 第 卷第期 ， ， 设计引物是为了保证目的片段插入载体时方向正确。 其次， 载体只需要单酶切， 用 酶切 ， 使得 成为两端都带着 位点的线性载体。相比双酶切割载体， 单酶切可以保 证酶切后的载体都是单一的线性片段， 使得后续的重 组连接更准确。第三， 省去了 克隆环节。因为 产物可以直接用于重组连接， 不需要酶切产生粘 性末端， 而且重组酶的重组能力强于 连接酶 的连接能力， 一般只需要一步即可重组连接成功， 因此 可以在重组反应之后进行测序鉴定。 两种方法各有利弊， 双酶切法构建过程比较繁琐， 同源重组法构建过程相对简单， 可以省去很多的时间 和精力， 但假阳性率略高。 【 参考文献】 ， ， ， ， ， （） ： ， ， ， ， （） ： 王福利， 赵爱志， 韩月恒 连接酶对电转化效率的影响 中国现代医学杂志， ， （ ） ： ， ， ， ， ， （） ： 刘斌， 羊小海， 王柯敏基于线性荧光探针对 连接酶的 活性分析高等学校化学学报， ， （ ） ： 邝翡婷， 袁定阳， 李莉， 李新奇一种载体构建的新方法： 重组融合 法基因组学与应用生物学， ， （） ： 欧阳平， 李玉， 严红， 等一种载体构建的新方法： 一步克隆法 湖北大学学报： 自然科学版， ， （） ： 陆云华， 马立新， 蒋思婧一种通用高效的复杂载体构建的新方法 遗传， ， （） ： 韩凯， 翁建峰， 郝转芳一种快速高效构建植物表达载体的方法 玉米学， ， （） ： ， ， ， ， ，（） ： 温继育， 邹文俊， 刘忠考， 等 真核质粒载体的构建 及 细胞转染广东医学院学报， ， （） ： ， ， ， ： ， ， （） ： ， ， ， ，（ ） ：