肠道病毒的分类与检测

.肠道病毒的分类与检测摘 要 肠道病毒可引发多种感染，并且发病以综合症出现，一种综合症可有不同病毒所引起，同一种病毒可以导致不同综合症是肠道病毒感染的普遍现象。目前除脊髓灰质炎外，尚无疫苗可供预防，是当前严重影响人类健康的重要病原之一。肠道病毒主要经粪一口或呼吸道传播，所以对肠道病毒感染作出准确、及时的诊断是非常必要的。肠道病毒（Enterovirus）是小RNA病毒科，有67个血清型。人类肠道病毒包括：脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）、柯萨奇病毒（Coxsackievirus）、埃可病毒（Echo）、甲型肝炎病毒以及新型病毒。目前常用的检测肠道病毒的方法有病毒分离培养、血清学鉴定、分子生物学方法，近年来，一些新型方法也使得肠道病毒的检测快速化与准确化。关键词 肠道病毒/诊断/分类1 肠道病毒形态特点 肠道病毒是球形、无包膜、核衣壳20面体立体对称。肠病毒属病毒粒子在酸性pH下稳定，在病毒制品中可观察到空衣壳，有时可观察到少量（1%）的重颗粒。基因组编码单一的VPg蛋白，但不编码L蛋白。不同肠道病毒及肠道病毒与鼻病毒间整个核苷酸序列一致性大于50%，一种肠道病毒不同株之间整个核苷酸序列的一致性大于75%。病毒主要在肠道细胞中复制，也能在神经、肌肉和其它一些组织中复制。大多数病毒感染无明显症状，病毒感染的临床症状包括轻微脑膜炎、脑炎、肌炎、心肌炎和结缔组织炎。耐酸和脂溶剂，不易被胃酸和胆汁灭活，在污水和粪便中活数月。2 肠道病毒的分类2.1 脊髓灰质炎病毒此病症的典型临床经过六个阶段（潜伏期、前驱期、瘫痪前期、瘫痪期、恢复期和残留麻痹）。感染期间患者表现为低热及咽痛、咳嗽、腹泻、不安、嗜睡、多汗、脑膜刺激症、肌肉疼痛、皮肤感觉过敏，突发急性弛缓性麻痹等症状，最后多遗留下终生残疾。脊髓灰质炎病毒通过患者的粪便或口腔分泌物传染。人类是脊髓灰质炎病毒的唯一宿主，长期携带病毒的情况（例如无症状，但仍持续排出病毒长达6个月以上）很罕见。服用脊髓灰质炎疫苗（现在我国使用I、II、III型混合糖丸疫苗，是由减毒的脊髓灰质炎病毒制成的）是预防本病的主要措施。消灭脊髓灰质炎最根本的手段是提高人群免疫水平，断绝脊髓灰质炎野毒株在人群中的传播。脊髓灰质炎病毒分为三个血清型；两种不同抗原：D抗原和C抗原。D（dense，致密）抗原：具有病毒RNA，为完整的病毒颗粒，又称N（native）抗原；C（coreless，无核心）抗原：不含RNA，是D颗粒经56 灭活，RNA释放后形成的无核酸空心衣壳，故又称H（heated）抗原；不同型别病毒C抗原可发生交叉反应，但D抗原无交叉反应；传播方式主要是粪-口传播，所致疾病是脊髓灰质炎。中毒机理：粪口途径传播为主上呼吸道，咽喉，肠道为侵入门户先在局部粘膜和淋巴结中增殖入血，形成第一次病毒血症带有受体的靶组织（脊髓前角细胞、背根神经节细胞、运动神经细胞等）在靶细胞中再次增殖后形成第二次病毒血症及临床症状。检测方法第一是微生物学检查，检测方法：病毒分离检查：取咽漱液、粪便等样本，细胞培养出现CPE；血清学诊断：中和试验；病毒核酸测定。第二是防治:口服减毒活疫苗或者注射灭活疫苗.2.2 柯萨奇病毒柯萨奇病毒2对乳鼠的敏感性很高，根据它们感染乳鼠产生的病灶，柯萨奇病毒可以分为a、b两组。a组有23型病毒，b组有6型病毒。A组病毒：诱发新生乳鼠弥漫性骨胳肌炎，导致驰缓性麻痹。B组病毒：诱发新生乳鼠局灶性骨胳肌炎，导致痉挛性麻痹。通过型特异性抗原，经中和试验。Elisa方法等可以对各型进行鉴定。所有的b组及a组的第9型有共同的组特异性抗原，在b组内病毒之间有交叉反应，但是a组病毒没有共同的组特异性抗原。a组某些型别的型特异性抗原可在37引起人类O型红细胞凝集反应。柯萨奇病毒A型感染潜伏期1-3天，上呼吸道感染，起病急，流涕、咳嗽、咽痛、发烧，全身不适。典型症状为疱疹性咽峡炎，即在鼻咽部、会厌、舌和软腭部出现小疱疹，粘膜红肿，淋巴滤泡增生、渗出，扁桃体肿大，伴吞咽困难，食欲下降。据调查（R0binson，1958）伴有口咽部疱疹和皮疹的急性热病中，79%为柯萨克A型病毒所致。检测方法：1.病人体液（脑脊液、疱疹液、心包液、胸水等）分离出病毒即可确诊。）2恢复期血清出现抗体，或双份血清抗体效价增高4倍以上。2.3 埃可病毒埃可病毒(ECHO)（ECHO-viruses）病毒即肠性细胞致病性人类孤独型病毒（enteric cytopatho-genic human orphan virus）。只对人类有感染性，多发于夏、秋季，绝大多数是隐性感染。ECHO病毒分为30多个型（1-34型，其中8、10、28、34型已归入其他病毒）。各型致病力和致病类型也不同，如ECHO6、19型致病力较强，它类似于柯萨奇病毒B型引起急性胸痛和心肌病。主要经口-粪途径传播，也可通过咽喉分泌物排除病毒经呼吸道传播。病毒进入人体在咽部机肠粘膜细胞增殖后，侵入血流，形成病毒血症。ECHO病毒感染的临床表现类似于风疹，第一孕季感染虽可累及胎儿，但很少引起畸形。发病年龄2.533岁，常见的症状为上呼吸道感染、发烧、非化脓性脑膜炎和皮疹。皮疹为斑丘疹或麻疹样皮疹，持续13天自然消退。可从大便、咽分泌物和脑脊液中分离出病毒。防治：埃可病毒疹尚无特殊疗法。皮疹对症处理。对易感的婴幼儿可注射丙球蛋白36ml，脊髓灰质炎减毒疫苗可干扰本病毒的感染。ECHO-3，4，6，9，11型减毒活疫苗正在研制中。目前尚未有特效治疗，主要采用对症和支持疗法。静脉注射人血丙种球蛋白对新生儿严重感染可能有效，婴幼儿腹泻也有导致脱水及酸中毒的可能，须酌情给予输液治疗。2.4 甲型肝炎病毒临床上表现为急性起病，主要表现为乏力、食欲减退、及肝功能异常，部分病例可出现黄疸。甲型肝炎病毒主要通过粪口途径传播，传染源多为病人。甲型肝炎的潜伏期为15-45天，病毒常在患者转氨酸升高前的5-6天就存在与患者的血液和粪便中。发病2-3周后，随着血清中特异性抗体的产生，血液和粪便的传染性也随之消失。从感染者的粪便中排出，通过不同的途径污染了食物和用具，又经过口侵入人体。这就是甲肝病毒的传播方式。2.5 新型病毒新型病毒指在1969年以后鉴定的除脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒以外的几种小RNA病毒，主要包括68-71共四个血清型。其中68型分离自下呼吸道感染者，69型分离自健康人肛门拭子，70型分离自急性出血性结膜炎患者，71型分离自无菌性脑膜炎患者的粪便和脑脊液。EV70主要引起流行性出血性结膜炎；EV71感染主要引起手足口病，还可引起中枢神经系统和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统疾病。3 检测方法3.1 病毒分离培养 利用组织培养技术从感染部位或传染源分离出病毒并鉴定其特异性血清型是病毒性疾病诊断的标准。病人标本是最常采集的标本。病毒培养对缩短抗生素治疗和住院期有积极作用，但是病毒的分离鉴定繁琐、费力、耗时，一般一周才能观察到细胞病理反应，而且许多肠道病毒不能进行细胞培养，或者可以培养但不出现细胞病理效应。3.2 血清学鉴定2分离病毒和利用组合血清中和试验是对病毒定型的重要方法。肠道病毒的血清学鉴定中，多选用组合血清。此方法检测中不适用于早期诊断，可作为回顾性诊断；且由于肠道病毒血清型众多，临床使用检测价值有限，而多为流行病学采用。3.3 分子生物学诊断3.3.1 PCR技术由于各型病毒具有共同基因组序列，也可检出几乎所有血清型。PCR检测材料用量少、快速、灵敏度高且具有特异性，并可通过设计不同的引物进行病毒分型，用于检测相当宽的肠道病毒血清型。卢亦愚3等人发明了用肠道病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法，灵敏度高，非常适用于如手足口病等有肠道病毒感染引起突发疫情的实验室早期诊断，该方法具有高特异性。3.3.2 核酸杂交技术4由于EV各型间存在序列高度保守区，利用针对此保守区的通用互补脱氧核糖核酸(cDNA)核酸探针可进行大范围的EV诊断。3.3 其他新型方法2000年，Notomi 等开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法， 即所谓环介导等温扩增法。5该方法利用一种链置换DNA 聚合(BstDNApolymerase)和两对特殊的引物，特异地识别靶序列上的6 个独立区域，使反应在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，从而保证引物可以在等温条件下(65左右)与模板结合并进行链置换扩增反应。 RT-LAMP 检测方法在满足特异性同时，灵敏度可达到普通RT-PCR 法的10-100 倍，或荧光RT-PCR 法的1/10 或与之在同一水平。优点：（1）高特异性 （2）高灵敏度 （3）鉴定简便 （4）操作简单 （5）快速、高效：整个扩增反应只需1-1.5小时5。参考文献 1 腾峥，张曦 上海市疾病预防控制中心微生物检验室 肠道病毒的检测方法及评价2