实验十三细胞凋亡的检测.ppt

细胞生物学实验之实验十三,细胞凋亡的检测,南开大学生命科学学院,二零零七年六月,实验目的,细胞凋亡的检测,了解细胞凋亡的检测方法,加深对细胞凋亡现象及本质的理解,练习从形态学角度评价细胞凋亡,掌握荧光显微镜的使用方法,细胞凋亡的检测,实验原理,基本概念：,细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞基因调控的一种自主性的自杀现象。或者说在一定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的程序，自我结束生命的死亡方式。由于这种死亡方式是由基因调控的死亡过程，因此又称之为程序性细胞死亡(ProgrammedCellDeath)。,细胞凋亡有别于细胞坏死。,似秋叶的凋零，告别生命之辉煌；那难以计数的攻击、诱导，轻启着道道程序，逼细胞步步走向生命的末端；啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡;,危难中的细胞啊，你沉稳不乱，DNA片片切割，化云梯直通天堂；细胞体分团相聚，把生命的凝重浓集在小体上；分别了朝夕相处的伙伴，再见了快乐美好的时光；这一切的一切又融入临近的胞体，腾出的空间再写生命的篇章。,细胞凋亡与细胞坏死的区别,坏死凋亡,1.性质,2.诱导因素,强烈刺激，随机发生,较弱刺激，非随机发生,3.生化特点,4.形态变化,6.DNA电泳,5.炎症反应,7.凋亡小体,8.基因调控,被动过程，无新蛋白合成，不耗能,主动过程，有新蛋白合成，耗能,细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀,胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩,弥散性降解，电泳呈均一DNA片状,DNA片段化（180-200bp），电泳呈“梯”状条带,溶酶体破裂，局部炎症反应,溶酶体相对完整，局部无炎症反应,有,病理性，非特异性,生理性或病理性，特异性,无,有,无,细胞凋亡的形态特征,（1）凋亡的起始；微绒毛的消失，细胞间接触的消失，与周围的细胞脱离，细胞质中，线拉体大体完整，染色质固缩（2）细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面（3）凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围（4）凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。,细胞凋亡的形态学特征,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元退行性疾病，病毒感染,细胞凋亡检测方法,基于形态学观察的染色法,基于DNA片断化的检测法,膜联蛋白检测法,Caspase酶分析法,流式细胞仪定量分析法,细胞凋亡的检测,实验原理,细胞凋亡的检测,实验仪器、材料及试剂,1、仪器、用具：荧光显微镜、显微载玻片、盖玻片、微量,2、培养的细胞材料：HeLa细胞,3、试剂：,吖碇橙/溴化乙锭（AO/EB)的PBS溶液：PBS溶液中分别加入100g/mL的AO与100g/mL的EB，配成两种溶液，用时再混合。,磷酸盐缓冲液（PBS)：800mL蒸馏水中溶解8gNaCL、0.2gKCL、1.44gNa2HPO4、0.24gkH2PO4，用盐酸调pH到7.4，加水定容到1L。高压灭菌保存。,移液器、高压灭菌锅、细胞培养用具,细胞凋亡的检测,实验步骤,（1）Hela细胞贴壁生长于DMEM培养液中含10%胎牛血清，置375%CO2培养箱中培养23天，待细胞形成单层融合状态。（2）去细胞培养液，加入0.215mol/L双氧水的10%胎牛血清培养液中，继续培养2436小时。（3）收集细胞：用细胞消化液消化细胞使细胞脱壁，制成单细胞悬液。1000Xg离心力离心5分钟，弃上清。（4）取25l培养的细胞悬液滴于载玻片上，稍风干后，加入AO/EB1:1混合液染色，并盖上盖玻片。（5）荧光显微镜下观察。,细胞凋亡的检测,注意事项,1、EB为强诱变剂，使用时要注意防护,2、试剂与细胞孵育完毕后，要立即检测,3、正确使用显微镜，保护好镜头和滤光片,细胞凋亡的检测,课后作业及思考,1、练习用AO/EB法检测凋亡的细胞，掌握荧光显微镜的使用,2、查阅相关文献，理清细胞凋亡与细胞坏死的区别,3、了解其它可用于细胞凋亡检测的方法及其原