第二章-发酵工业菌种PPT课件

.,1,发酵工程,FermentationEngineering,广东石油化工学院化学与生命科学学院,.,2,第二章,发酵工业菌种,.,3,本章内容,一、常用的工业微生物二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术三、发酵工业菌种改良四、发酵工业菌种保藏,.,4,一、最常用的工业微生物,细菌醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌乳酸杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌,.,5,最常用的工业微生物,酵母菌酿酒酵母假丝酵母属产朊假丝酵母解脂假丝酵母热带假丝酵母毕赤酵母属、汉逊酵母属,.,6,最常用的工业微生物,霉菌曲霉属米曲霉黑曲霉青霉属青霉菌：点青霉、产黄青霉桔青霉根霉属德氏根霉米根霉、小麦曲根霉红曲霉属紫红曲霉,.,7,最常用的工业微生物,放线菌链霉菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌,.,8,未培养微生物,定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99。研究方法模拟自然培养法:原位培养、培养条件优化、单细胞操作宏基因组分析法,.,9,二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术,（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求（二）分离筛选原理与技术（三）应用举例,.,10,1.菌种选择的总趋势,野生菌变异菌自然选育代谢控制育种诱发基因突变基因重组的定向育种,.,11,2.菌种选择的要求,能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；培养条件易于控制；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；,.,12,2.菌种选择的要求（续）,菌种不易变异退化；对放大设备的适应性强；菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。,.,13,（二）分离筛选原理与技术,1.筛选的指导思想2.分离筛选工作在实际中应用的几个方面3.新种分离筛选原理与技术,.,14,1.筛选的两种指导思想,先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。结果有两种可能：获得适于工业发酵菌株只获得选育所需的出发菌株,.,15,2.分离筛选工作在实际中应用的几个方面,从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；生产中长期使用的菌种的定期分离筛选；从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株；从已知菌种和大自然中分离新菌株寻找新的发酵产品的产生菌；寻找老产品的新的优良菌株。从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处：经济性指导性,.,16,设计筛选方案时必须考虑两个要点,选择性灵敏度,.,17,3.新种分离与筛选的步骤,调查研究（包括资料查阅）试验方案设计含微生物样品的采集（如何使样品中含所需微生物的可能性大？）样品预处理（如何在后续的操作中使这种可能性实现）菌种分离,根据目的菌株及其产物特点分选择性分离方法随机分离方法(定向筛选选择压力)(用筛选方案-检测系统进行间接分离）富集液体培养固体培养基条件培养(初筛)菌种纯化复筛,菌种纯化初步工艺条件摸索再复筛生产性能测试较优菌株1-3株保藏及进一步做生产试验某些必要试验和或作为育种的出发菌株毒性试验等,.,20,含微生物样品的采集,采样时应注意的问题:土壤微生物的分布采土深度土壤植被情况采样季节土壤的酸碱度对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：土壤来源广泛在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种,.,21,样品的预处理,目的：提高分离效率方法：物理方法：热处理；膜过滤法；离心法化学方法诱饵法,.,22,分离方法的选择,根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法菌种的营养特征独特生长特征独特无选择性特征根据产物的特征进行随机分离选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。,选择性分离,.,23,选择性分离原理和技术,生长条件的选择与控制原理控制营养成分控制培养基酸碱度添加抑制剂控制培养温度控制通气条件选择性分离技术富集液体培养技术固体培养技术,施加选择压力，进行定向筛选,.,24,A.富集液体培养,增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件培养方式分批培养方式：以最大比生长速率（max）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题连续培养方式：以比生长速率（）筛选,A,B,S0,基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（）的影响当SS0时，富集什么菌株？,.,26,连续富集培养技术分离菌株的优点,分离的菌株特别适合连续发酵生产过程有利于分离具有某种工业生产特性的菌株可以筛选出能共生的稳定混合培养物,.,27,B.固体培养技术,常用于分离某些酶产生菌选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质,.,28,随机分离原理与技术,从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。随机分离技术举例抗生素产生菌的筛选药理活性化合物产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选多糖产生菌的筛选,.,29,高产培养基设计的几个原则,制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素；使用一聚合或复合形式的生长限制养分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物阻遏；确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH缓冲剂以减少pH变化；前体、促进剂及抑制剂的采用。,.,30,抗生素产生菌的筛选,筛选模型：试验菌筛选方法：铺菌法复印平板法液体培养筛选抗药性筛选筛选模型：氨苄青霉素和-内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同III无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性,固体培养筛选,试验菌代表微生物类型金黄色葡萄球菌209p革兰氏阳性球菌枯草杆菌6633革兰氏阳性杆菌大肠杆菌革兰氏阴性肠道细菌耻垢分枝杆菌607结核杆菌白色念珠菌酵母状真菌青霉菌丝状真菌,.,32,药理活性化合物产生菌的筛选,药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到治疗的目的。筛选模型：目标酶,.,33,生长因子产生菌的筛选,筛选模型：营养缺陷型试验菌筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进营养缺陷型试验菌生长,氨基酸产生菌的筛选,样品预处理初筛（除真菌）在分离平板上生长获得多个单菌落复印平板（copy法）平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸对应到copy前相应u.v线杀死长好的菌落位置，找到目的菌落再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂培养后产氨基酸菌落周围有生长圈,目的菌落进行液体培养，对产物进行定量测定,筛选产物含量高的菌株,.,35,多糖产生菌的筛选,取样特点：碳水化合物工业的废弃物筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。,细菌分离：以乳酸菌为例,取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中加麦芽汁至瓶口处，封塞，25培养24-48h培养基中长出绢丝状波动物，镜检杆状，阳性染色初步断定乳酸菌用选择性培养基分批富集培养2-3代稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基根据透明圈挑选菌落性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）Rf值定性（有机酸呈黄斑点）乳酸生成量测定（滴定法）,放线菌的分离：以产链霉素菌种的分离为例（从退化菌种中筛选）,取工业发酵液（含孢子）样品1环放入带玻璃珠的装有10ml无菌水的小三角瓶中，摇匀采用稀释法制平板，获取单菌落斜面保藏高产菌恢复根据高产菌的特点，选择目的菌落放大培养，发酵液性能测试,筛选模型：形态依据,真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例,取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7稀释分离法取0.1ml加入固体培养基铺平皿（2）在麦芽汁固体培养基上，25培养48-72h形态筛选根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次生成子囊孢子速度测定发酵力测定性能测定热死温度测定凝集力测定双乙酰含量测定,.,39,菌种选育改良的具体目标,提高目标产物的产量提高目标产物的纯度，减少副产物改良菌种性状，改善发酵过程改变生物合成途径，以获得高产的新产品,.,40,发酵工业菌种改良方法,常规育种(诱变育种)细胞工程育种基于代谢调节的育种技术基因工程育种蛋白质工程育种代谢工程育种,.,41,常规育种,常用手段：诱变和筛选（1）诱变育种：诱变剂（改变自发突变频率）,.,42,平皿快速检测法形态变异的利用高通量筛选,（2）筛选方法,.,43,细胞工程育种,细胞水平上操作菌种，采用接合、转化、转导、原生质体融合等遗传学方法手段：杂交育种和原生质体融合,.,44,杂交育种,杂交育种一般指两个不同基因型的菌株通过接合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。,杂交育种的本质：基因重组,.,45,原生质体融合,通过人为方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并发生重组子的过程，称为原生质体融合或细胞融合。,.,46,基因工程育种,基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。,.,47,基因工程的基本操作步骤,1、目的基因的取得2、载体的选择3、目的基因与载体DNA的体外重组4、重组载体引入受体细胞5、表达筛选,.,48,.,49,原核表达系统：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等真核表达系统：酵母菌（真核蛋白质的最适表达系统）,外源基因引入受体后，能否很好地表达，表达所形成的外源蛋白能否分泌或到达催化反应的场所等，是关系到能否工业化应用的问题。,.,50,随着基因工程技术的发展，将高等生物的基因克隆到大肠杆菌中，由大肠杆菌发酵生产人胰岛素、人生长激素和干扰素等高附加值药物产品已工业化生产。同时，在微生物发酵生产的其他产品中，重组DNA技术对产量的提高及性状的改良等也得到了广泛的研究和应用。,.,51,采用合适的筛选方法，诱变育种可以获得高产菌株。但不能达到定向育种的目的。随着现代生物技术的发展，杂交育种，原生质体融合，基因工程技术可达到改良菌种的目的。,育种实例,赖氨酸生产菌种的选育改良思路,出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌育种思路1.优先合成的转换渗漏缺陷型的选育2.切断支路代谢营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型3.抗结构类似物突变株的选育：AEC(3-Amino-9-ethylcarbazole)4.解除代谢互锁：Leu-、抗Leu结构类似物、喹啉s、苯醌s5.增加前体物的合成和阻塞副产物的生成：Ala-、抗Asp结构类似物选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株6.改善细胞膜的透过机能7.选育温度敏感突变株8.应用细胞工程和基因工程育种,育种实例,.,54,选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株,赖氨酸合成中间代谢有以下两条途径：通过TCA循环葡萄糖丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸赖氨酸通过磷酸烯醇丙酮酸羧化反应葡萄糖磷酸烯醇草酰乙酸天冬氨酸式丙酮酸丙酮酸赖氨酸,.,55,代谢工程的定义,利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。又称作途径工程，是多基因的基因工程。,.,56,代谢工程发展基础,代谢网络理论：是把细胞的生化反应以网络整体，而不是孤立地来考虑。代谢网络分流处的代谢产物称为节点，其中对终产物合成起决定作用的少数节点称为主节点。根据节点下游分支的可变程度，节点分为：柔性节点：解除一个分支的反馈抑制可提高该分支下游产物的产量。半柔性节点：须降低主分支的酶活并同时提高次分支的酶活或解除其反馈抑制，才可提高次分支下游产物的产量。刚性节点：其下游各分支的比例不易改变。,.,57,代谢工程发展基础,相依网络：代谢网络中各主节点集中于产物，为了避免中间物的过量积累，各分支的代谢流都必须保持平衡，各分支的分流相等，各节点的重要性相同。独立网络：代谢网络的主节点不集中，可以通过对代谢的修饰来影响产物的产量,其对代谢修饰的应答能力，取决于各节点的刚柔性及其位置。SIPSPBB1B2,相依网路,独立网路,.,58,代谢工程育种思路,1.改变代谢流：改变分支代谢途径的流向，阻断有害代谢产物的合成。（1）加速限速反应（2）改变分支代谢途径流向：提高代谢分支点的某一分支代谢途径酶系的活力，在与另外的分支代谢途径的竞争中占有优势，可以提高目的代谢末端产物的产量。（3）构建代谢旁路（4）改变能量代谢途径,.,59,代谢工程育种思路,2.扩展代谢途径（1）在引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端代谢产物。（2）使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料生物合成代谢末端产物。,.,60,代谢工程育种思路,3.转移或构建新的代谢途径1)转移代谢途径:为生产某一新的化学结构的代谢产物，将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一不具备该种能力的微生物中，达到代谢途径转移的目的，使之具备生产该种新化合物的能力。2)构建新的代谢途径:利用基因工程手段，通过克隆少数基因将原来细胞中无关的两条代谢途径桥连在一起，形成新的代谢途径。,.,61,诱变育种，通过诱变剂促进突变频率的提高，但这种方法有很大的盲目性，基因变异的程度也有限，特别是经过长期诱变处理，产量上升变得越来越缓慢，甚至无法继续提高。几乎与诱变育种在同一时期，由于对微生物有性生殖、准性生殖、转化、转导及接合等现象的研究，出现了杂交育种（即基因重组技术）。因为是在已知不同性状的亲本间杂交，所以方向性和自觉性比诱变育种更进了一步。但杂交育种方法较复杂，而且需要有合适的亲本（亲本间应具有能互补的优良遗传性状及亲本间有性的亲和性）。,几种育种方法的比较,.,62,原生质体融合进一步发展了杂交育种技术，它可使一些未发现有转化、转导和接合等现象的原核生物之间，及微生物不同种、属、科间甚至更远缘的微生物的细胞间进行融合，获得新物种。但原生质体融合的难度也很大，并非每次都能成功。,.,63,70年代出现的基因工程给微生物育种带来了