英语多生物芯片技术

生物芯片技术Biochips Technology,教 学 要 求,掌握：1 基因芯片的设计原理和基本方法 2 各种芯片的使用及意义了解：1 各种芯片的分类特点 2 基因芯片的操作及结果分析,Driving the Genetic Revolution,基本概念,基因gene基因组genome 生物单体中一套完整的遗传物质, 即全部基因结构基因 非编码基因, 一般不显示功能功能基因 编码基因, 产生功能蛋白,人类基因组30亿碱级对组成；共编码约3.5万基因。cDNA 是基因转录过程mRNA的互补DNA，代表了基因的生物学信息。EST expressed sequence tag 表达序列标签, 是长度为300500bp的cDNA片段。用于克隆全长基因; 制备基因表达谱。SNP single nucleotide polymorphic allele 单核苷酸多态性等位基因。,芯片的基本概念,生物芯片 主要指通过平面微细加工技术，在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。基因芯片 技术是通过微阵列技术, 将高密度DNA片段阵列通过高速机器人，以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。微阵列技术 微阵列技术巨大优势在于它可以并行地宏量获取生物信息，借助此技术发展的生物芯片，则提供了以核酸杂交为基础的基因水平的表达监控，多态性研究和基因分型。从而使我们对基因表达调控有更深入的了解。,微阵列芯片（Microarray）微型实验室芯片(Lab-on-a-chip)液体芯片(Liquichip),生物芯片分类,基因芯片蛋白芯片组织芯片,什么是组织芯片？,定义：将数十个、数百个乃至上千个小的组织片整齐地排列在载体上（通常是载玻片）而成的微缩组织切片,它是一种高通量、多样本的分析工具。,何谓蛋白芯片？,蛋白芯片：将多种蛋白质以微阵列的形式固定在固相或液相支持物上，在孵育反应中与样品中靶分子的结合，并用报告分子检测结合信号。抗体芯片：将不同抗体按照类似基因芯片的方法点阵在特定的片基上，通过抗原抗体结合来对检测样品中的蛋白作定性和定量分析。作用：可以在一次实验中比较生物样品中成百上千的蛋白质的相对丰度,RNA,蛋白质,转录,翻译,细胞表型生物表型,复制,逆转录 (病毒中),？ ？ ？ ？,生物学中心法则 分子生物学的基本原理,DNA,基因芯片发展历史,Southern & Northern Blot,Dot Blot,Macroarray,Microarray,基因芯片分类,按功能划分基因组芯片 检测某一基因是否存在，若存在，拷贝数是多 少。探针是DNA. 表达谱芯片 确定基因表达的途径与表达产物。探针是RNA或cDNA。测序芯片 通过探针与微阵列的配对分析获得探针的序列结果。按探针类型划分cDNA芯片：几百到上千个碱基Oligo芯片:25mer(affymetrix)；70mer(Operon)；80mer（Clontech）,用Gene Chip作为主要研究手段发表在国际杂志的研究论文,基因芯片研究的总体方案,图象扫描/结果分析,杂交/洗涤,芯片,标记好的样品,点样（针点或喷点）,探针标准化,Oligo探针合成,Oligo探针序列确定,基因组序列分析,组织样品,目的细胞,总RNA提取,cDNA,mRNA,基因文库构建,目的基因扩增,PCR产物纯化,The Process,Gene chips for genes expression analysis,Standard eukaryotic gene expression assay. The basic concept behind the use of GeneChip arrays for gene expression is simple: labeled cDNA or cRNA targets derived from the mRNA of an experimental sample are hybridized to nucleic acid probes attached to the solid support. By monitoring the amount of label associated with each DNA location, it is possible to infer the abundance of each mRNA species represented. Although hybridization has been used for decades to detect and quantify nucleic acids, the combination of the miniaturization of the technology and the large and growing amounts of sequence information, have enormously expanded the scale at which gene expression can be studied. For more detailed information, review the GeneChip Expression Analysis Technical Manual.,The Result,A light source scans the array, causing the dyes to fluoresceThe glow is picked up by a sensor and is used to determine the relative abundance of the RNAThis information must be processed to determine the level of activity for each expressed gene,（一 ）探针设计与合成,探针标准化,Oligo探针合成,Oligo探针序列确定,基因组序列分析,基因文库构建,目的基因扩增,PCR产物纯化,cDNA探针,Oligo探针,探针设计的要求,高度特异性较高灵敏度,cDNA探针的缺点,由于不同的基因长短不同，Tm值各异，成千上万的基因在同一张芯片上杂交，使得杂交条件很难同一。同一个体中总是存在一些基因家族的同源序列，加上有的物种存在基因重叠序列的相互干扰，使得传统的cDNA芯片的分辨能力受到限制，结果的准确性也受到影响。有些组织中在DNA双链中的无意义链中存在重叠的基因；而且不同RNA的剪切方式等基因表达方式很难用cDNA芯片来区分。PCR产物是结合稳定的DNA双链，加入探针后在杂交中必然存在竞争性抑制，影响探针和模板的结合能力和稳定性，进一步影响cDNA芯片的分辨能力和结果的可信度，这对于低丰度的基因影响尤为明显。PCR产物浓度不均一也可能导致错误的结论。,cDNA探针无法区别同源基因,基因1,基因2,基因3,基因1cDNA探针,基因2cDNA探针,基因3cDNA探针,cDNA探针空间结构影响杂交效率,Signal Intensity,0 2 1,Quantitative No Reproducible No,寡核苷酸探针比cDNA探针的优点,探针序列经过系统优化，减少非特异杂交，能有效区分有同源序列的基因；减少二级结构 及其对杂交结果的影响杂交温度均一，提高杂交效率；合成产物浓度均一，避免因样品浓度差异而造成点样量差异 ；可以设计检测不同剪切方式的基因；无需扩增，防止扩增失败影响实验 。,单个长片段Oligo探针,全长基因序列,Oligo探针,5,3,单点或重复,GeneChip 表达谱探针设计原理,全长基因序列,多段探针,完全匹配,不完全匹配,5,3,多段寡核苷酸探针,基因1,基因2,基因3,基因2多段OLIGO探针,基因3多段OLIGO探针,基因1多段OLIGO探针,探针长度与特异性和灵敏度,Perfect Match PM,MM Mismatch,PM-MM探针设计,Oligo 探针,Excellent Discrimination of Mismatch Base Sequence,PM-MM设计作用-有效的扣除掉芯片上面的背景,其他的基因芯片只是用片基上空白处的杂交信号作为背景扣除，空白背景水背景核苷酸背景与这条MM探针结合的信号里面有一部分就是背景信号，在实际计算每一点的实际的信号值时，这些信号将被去除， 最终获得准确的数据并有利于在低丰度基因表达的准确定量。,PM-MM Probe Pairs Offer High Sensitivity,Discriminate against background signals Increasing sensitivity at low target concentrations,探针特点总结,cDNA探针特异性最差；检出限最低，但并非真实灵敏度单个长的Oligo探针保证较好的特异性和灵敏度，是不得已的折中路线；多个Oligo探针： 25bp探针保证最高特异性 多段探针保证最高的灵敏度 PM-MM探针设计有效扣除假阳性,（二）样品制备与标记,标记好的样品,组织样品,目的细胞,总RNA提取,cDNA,mRNA,标记物,标记方法,荧光素,放射性同位素,金属粒子,反转录标记,PCR标记,随机引物标记,样品制备与标记的质控,TEST 芯片监控RNA提取及反转录的完整性监控RNA提取及反转录的灵敏度监控系统操作的灵敏度,标记方法的区别,双色标记：Cy3,Cy5标记效率不同，相同的杂交探针不同的荧光信号，不能进行直接比较，必须进行反标记校正。单色标记：标记效率相同，信号值可直接进行比较。,（三）生物芯片制作技术,生物芯片制作方法分类,原位合成(In Situ Synthesis),压电打印原位合成分子印章原位合成原位光刻合成,Fabrication,Fabrication via PrintingDNA sequence stuck to glass substrateDNA solution pre-synthesized in the labFabrication In Situ Sequence “built”Photolithographic techniques use light to release capping chemicals365 nm light allows 20-m resolution,原位光刻合成,美国著名的Affymetrix公司率先开发的寡聚核苷酸原位光刻专利技术，是生产高密度寡核苷酸基因芯片的核心关键技术。 优点： 合成效率高，点阵密度高 缺点： 设备昂贵，技术复杂,原位光刻合成原理,Light directed oligonucleotide synthesis.A solid support is derivatized with a covalent linker molecule terminated with a photolabile protecting group. Light is directed through a mask to deprotect and activate selected sites, and protected nucleotides couple to the activated sites. The process is repeated, activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to be constructed at each site.,Affymetrix uses a unique combination of photolithography and combinatorial chemistry to manufacture GeneChip Arrays.,GeneChips Probe Arrays,Quantitative Yes Reproducible Yes,（四）、杂交/洗涤技术,杂交技术的关键在于使杂交洗涤条件的标准化、均一化,方法,盖玻片,杂交盒,全自动杂交洗涤工作站,（五）基因芯片检测技术,非共聚焦激光扫描仪激光共聚焦扫描仪,基因组芯片在临床研究领域的应用,Eukaryotic Cell,DNA,RNA,Genotyping and Gene Expression Monitoring,Genotyping: Is it A or B?,Gene Expression: Which genes? How much?,（一）人类全基因组分析,HuSNP Applications,Linkage Studies (确定疾病相关基因在染色体的位置) human familial linkage studies to map disease-associated genes to specific chromosomal locationsLOH (Loss of Heterozygosity, 杂合子缺失研究以确定癌细胞中染色体缺失的位置和程度)compare the quantitative representation of alleles for samples obtained from normal tissue to those obtained from tumor tissue to determine the location and extent of chromosomal loss in tumor cells 揭示个体间差异的遗传基础,美国、加拿大、英国和欧洲其他国家超过50个研究中心组成科学研究小组170多位专家，利用Affymetrix研发SNP新技术，扫描1500个有自闭症孩子家庭基因与自闭症之间可能存在的联系over fifteen publications in less than the year since its launch， Mapping Arrays for applications including linkage analysis, population genetics, and chromosomal copy number changes during cancer progression,SNP Genotyping Using Molecular Inversion Probes,The SNP genotyping process using molecular inversion probes is outlined diagrammatically in below.10,000 multiplex MIP assay detected on Tag Microarray,Allelic imbalance analysis by high-density single nucleotide polymorphic allele (SNP) array with whole genome amplified DNA,osteosarcoma tissues vs patient-matched blood,Nucleic Acids Research, Vol. 32 No. 9 Oxford University Press 2004;,应用实例1,Copy number of individual SNPs in chromosome 6 detected from case OST1976q12-13 have 5- to 20-fold amplification by reference dataconsistent with CGH result,Significance graph of detecting copy number changes. An example for chromosome 6 of OST197loss of 6q14-q27 gain at 6q1213confirmed by CGH,SNP loci at 6q12-13 are within a region of LOH but also have significant increase in copy number. The increase in copy number in a LOH region may suggest the loss of an allele followed by amplification of the remaining allele.- The ability to make such an inference is one of the advantages of SNP array over other microarray-based methods such as the use of cDNA and BAC for allelic imbalance analysis.,SNP Array Advantage,Traditional Method in LOH Detection,Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)Microsatellite markers,（二）表达谱芯片在临床研究中的应用,表达谱基因芯片,表达谱基因芯片通俗地讲是指用于基因功能研究的一种基因芯片。研究基因在不同组织或细胞、不同发育阶段中基因表达的改变，进而阐明基因的功能。,应用表达谱芯片的意义,表达谱基因芯片可以快速、有效地帮你寻找到与您研究领域相关的靶基因。 在人类10万种基因中，目前已研究过的基因仅2000-3000种，绝大部分基因尚处于待研究阶段，通过基因芯片您可以获得最多待研究基因。 通过对大量未知基因的研究，您可以获得更多的基因功能专利，而专利就是财富。,表达基因芯片检测示意图,Gene Logic GeneExpress database suite,BioExpress研究人和动物正常组织和病变组织基 因表达规律,揭示疾病发生分子机制,包括了解生理病 理过程涉及的分子的相互关系ToxExpress研究各种毒素引发的基因表达规律,筛 选合适的毒理标志分子,评估药物毒理作用,比经典的临 床前安全测试方法(临床化学和组织病理学等)更有效PharmExpress研究典型药物药理作用的分子机制,表达谱基因芯片检测原理,用不同的荧光染料通过逆转录反应将不同组织或细胞的mRNA分别标记成不同的探针，将探针混合后与芯片上的基因进行杂交、洗涤，用特有的荧光波长扫描芯片，得到这些基因在不同组织或细胞中的表达谱图片，再通过计算机分析出这些基因在不同组织中表达差异的重要信息。,Clinical Trials Process Flow - Expression,基因芯片技术在药物筛选中的应用,Target Identification,Pharmaceutical ChallengeSolve complex, multifactorial diseases such as cardiovascular, neurodegenerative, and cancerFind novel targets for high-value therapeutic productsGeneChip SolutionGlobal transcriptome analysis is possibly the best way to unravel complex disease Genome-wide, high-density association studies will allow the determination of genetic basis of disease susceptibility,Compound Screening,Pharmaceutical ChallengeDetermine the numerator and denominator of the therapeutic index at an earlier point in the discovery processPrioritize compounds sooner in the screening processGeneChip Solution Build robust databases to characterize indexes of genes that can be correlated with efficacy and toxicityPerform information-rich screening using automated, high-throughput gene expression analysis system,Preclinical and Clinical Trials,Pharmaceutical ChallengeFaster, more effective trials that are more predictive of human trials (preclinical) and clinical outcomes (clinical)Genetic and genomic information that meets regulatory requirementsGeneChip SolutionHighest quality products that deliver reproducible resultsCustom design capabilities allow selection and cost-effective screening of specific genes of interestCommitment to understanding and meeting regulatory requirements,寡核苷酸微阵列对正常结肠、结 肠腺瘤、结肠腺癌的基因表达谱分析,实例2,用基因表达和聚类分析的方法能否鉴别良性和恶性肿瘤进一步研究正常组织病变成腺癌的过程中基因表达,研究目的,实 验 设 计,肿瘤组织,腺瘤或腺癌患者,正常组织切片,腺瘤或腺癌 组织切片,正常组织,疾病发展过程,正常,结肠腺瘤,结肠腺癌,表达谱比较,芯片统计分析,统计分析统计学软件Statistica（Stat-Soft. Tulsa. OK）聚类分析Cluster 20.2 进行聚类Treeview1.45浏览分析结果图,一些基因的表达经半定量RT-PCR进一步证实epithelial tissue was grossly dissected free of underlying stromal and muscular elements,在腺瘤与腺癌中均过量表达的产物Mr 100,000 coactivator (by 11-fold)BIGH3 (8.9-fold)ckshs2 (2.7-fold)MGSA (2.1-fold)matrilysin (3.0-fold). 在腺瘤与腺癌中均下调表达的产物:The colonic epithelial cell product, guanylin (111-fold), down-regulated in adenocarcinoma (40-fold)hevin (7.2-fold).,结肠腺瘤与结肠腺癌相比,聚 类 分 析,聚类分析结果,这组基因在腺瘤组织中高水平表达，比腺癌或正常组 织中的表达都更活跃。 包括几个转录因子（其中一些可能为癌基因,XBP-1、SSRP1、ETS-2、SOX9）、核糖体蛋白（S29和S9）、一个凋亡诱导因子（NBK）和一个剪切因子（SRp30c） 推测这些基因很可能在腺瘤向腺癌转化的早期起一定的作用。,基因簇1,这个基因簇在腺癌中特定高水平表达包括许多在结肠瘤(colorectal neoplasia)中高表达的已知基因产物，如Ckshs2、MGSA、matrilysin和一些与代谢率和繁殖相关的基因。,基因簇2,这组基因在正常组织中高水平表达，这些基因(guanylin, colon mucosa antigen)，在结肠瘤组织(colorectal neoplasms)中的表达是抑制的。这些基因还包括平滑肌和结缔组织相关基因。,基因簇3,用寡核苷酸微阵列技术可鉴定出在腺瘤向腺癌转化过程中起一定作用的基因进一步确认已知表达发生变化的基因，在肿瘤转移过程中表达发生改变证明用基因表达谱可区分正常组织表型上十分相似的结肠腺瘤和腺癌,结 论,Cluster diagram of gene expression profiles of 29 pediatric ALL samples,Bone marrow aspirates from pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia,The researchers developed new algorithms to analyze the gene expression data and classify patients depending on their risk for failing therapy. The number of genes required for classifying patients varied among the subtypes. A single gene was sufficient to achieve 100 percent accuracy for two ALL subtypes.,Moving to the Clinic,Classifying AML, ALL and MLL,Lung Cancer Classification,Colon Cancer Classifications,Prognosis for Pediatric ALL,Armstrong, S.A., et al. Nature Genetics 30: 41- 47, 2002,Affymetrix, Inc. non published data,Bhattacharjee et al. PNAS98(24),13790-5,2001,Ross, M. E. et al. Blood102,2951-9,2003,（三）组织芯片在临床研究领域的应用,表达谱分析结果的快速高通量后续验证,组织芯片灵活的研究工具,组织芯片的优点,可提高实验效率，减少实验误差高效、快速、低消耗、自身内对照和可比性强应用范围广形态学观察，免疫组织化学染色、原位杂交(FISH)、原位PCR (MSP-ISH )和各种原位组织、细胞学的观察和研究,组织芯片的研究意义,1. 实现高通量的组织样本研究,Human Molecular Genetics, 2001, Vol. 10, No. 7,组织芯片的研究意义,检测特定基因或蛋白在不同组织中的表达变化,基因芯片肾癌细胞系5 184种cDNA89种差异表达的基因编码Vimentin基因,组织芯片和基因芯片技术结合在肿瘤生物学的研究应用实例,Moch H. et al. Am J Pathology,1999, 154:981-986.,Bubendorf L et al., 1999, Cancer Res Mar 15;59(6):1388,组织芯片和FISH技术结合在肿瘤生物学的研究应用实例,（四）蛋白质芯片在临床研究领域的应用,功能验证及临床应用,临床应用的芯片分类,按照反应类型： 抗原-抗体芯片 受体-配基芯片 酶-底物芯片按照芯片的用途 蛋白质组芯片 临床检测芯片 药物筛选芯片 代谢工程芯片,蛋白质芯片（Protein Chip）,蛋白分析技术高通量微型化自动化多样化,蛋白功能芯片蛋白检测芯片,蛋白质芯片的类型,蛋白质芯片的类型,蛋白质微阵列三维凝胶块芯片微孔板蛋白质芯片,蛋白芯片的应用,诊断疾病 如传染病、肿瘤、遗传病及心血管疾病等 蛋白质相互作用研究 识别蛋白质激酶的底物 蛋白质与DNA,小分子相互作用研究 样品的分离和分析 微流体芯片,蛋白芯片的应用前景,抗体芯片新一代的蛋白分析手段,抗体芯片特点,特异性高 利用单克隆抗体芯片，可鉴定未知抗原/蛋白