感受态细胞和质粒DNA的转化(C)ppt课件

.,感受态细胞和质粒DNA的转化,.,导入大肠杆菌:氯化钙转化法electroporation电击法又叫电穿孔法体外包装感染法重组DNA导入哺乳动物细胞:DNA-磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖转染法脂质体介导法、原生质体融合法酵母菌转化法:完整细胞转化法原生质体转化法电击法,.,大肠杆菌(Escherichiacoli),大肠杆菌(Escherichiacoli)大约含3000kb的环状染色体DNA的棒状细菌。革兰氏阴性、兼性厌氧。最适生长温度37，PH7.07.6(一般7.4)，保存加甘油，培养皿密封。大肠杆菌的生长曲线可分为迟缓期(生长滞后期)、对数生长期(2030min)、稳定期(饱和期)，约11092108/mL和衰老期。,.,.,大肠杆菌的不同菌株的保存期差别较大。有些菌株在液体培养基中，4可保存几个月，而有些菌株在相同条件下只能保存几天。如在相同条件下，大肠杆菌K12株比大肠杆菌X1776株保存期长。所以菌株首先应划平板分离单个菌落，经扩增后再做抗药性等鉴定，然后应用或保存。保存一般用对数生长后期的细菌。根据不同需要做短期、中期或长期保存。,2.菌株的保存,.,LB琼脂平板划线，37，倒置平板培养(16-24hr)，形成单一菌落后，用石腊纸(parafilm)将平皿四周封严(使平皿隔绝空气)，倒置放入4或-20冰箱中，可保存数周。E.coli菌株的生存期差别大：有些菌株在液体培养基中，4能存活几个月。有些菌株只能活几天。穿刺琼脂(stabagar)，室温，避光可保存数年。冰冻：单一菌落，液体培养基中扩增后，稀释后倒入10-50%甘油培养基中，分装，置-20-70。可经过30次冻融，细菌仍然存活。菌LB中过液培养，加入等体积2冰冻培养基。液氮速冻后置-70，可经15次冻融，保存5年以上。,具体保存方法：,.,菌株保存液的配制,.,高压灭菌Phagemid-20Enzyme-20Buffers-20Primer-4Thiodeyivatives-20Ribonucleotides-20Helperphage-4置于20或80，并一个月检查一次,.,抗生素的配制,.,大肠杆菌感受态细胞制备和贮存,在基因工程研究过程中，常常需要将外源DNA与载体DNA连接，重组后，导入大肠杆菌受体细胞中，进行DNA复制，扩增或表达，噬菌体单链或双链DNA导入大肠杆菌宿主菌中复制扩增。但很久以前人们就试图将DNA转化大肠杆菌但都没有成功。因此长期以来人们一直认为大肠杆菌缺乏天然的转化机理。1970年M.Mandela和A.Higa提出，在转化DNA之前，预先用氯化钙溶液处理大肠杆菌，能够人为地诱导这些大肠杆菌细胞呈现感受态，这种细胞称为感受态细胞。从而提高重组DNA转化入大肠杆菌的转化频率。目前对这种机制尚不清楚。,.,感受态细胞(Compenentcells)：将质粒DNA或重组质粒DNA转化到宿主菌中之前，必须使细菌呈感受状，即有能力摄取DNA的状态。(主要介绍用氯化钙溶液处理大肠杆菌制备感受态细胞的方法),取出大肠杆菌HB101菌种管划LB琼脂平板，-70保存，37过夜(一般16小时)。取一个菌落接种于35mlLB培养管中，37振培养，过夜(816小时)。取出1mL过液菌加入新鲜配制的LB培养液50mL中(2%接种量)。37振荡培养，24小时。测定光密度值(约5107个细胞/mL)，OD550达0.30.5。注意：不同的大肠杆菌菌株，每mL培养物中细菌存活数与光密度值间关系不同。HB101，OD600=0.5（约107个细胞/mL）X1776，OD600=0.2（约107个细胞/mL）,.,细菌培养管取出置水浴中，1015分钟。细菌移入预冷的离心管中，44000GSA转头，转离心5分钟；弃上清，留沉淀置于冰浴中。加0.1mol/LCaCl2(预冷)溶液25mL，将沉淀充分悬浮，置冰浴中2030分钟。延长CaCl2处理时间，可增加感受态，所以也可在0过夜。4，40002500rpm转离心5分钟，弃上清，留沉淀，置冰浴中。用预冷的0.1mol/LCaCl2溶液2.5mL，小心轻轻悬浮沉淀，4过夜。可直接使用。次日加20%(最终浓度)灭菌预冷甘油。分装成每Eppendorf管200uL。,新鲜感受态细胞用于质粒DNA转化最好。但新鲜感受态细胞04贮存不超过3天。长期保存，必须将细胞在-70干冰或液氮气体部分速冻5分钟，再置于-80冰箱中保存，一般可保存1年。,.,CaCl2处理4，0.1M低渗CaCl2处理使细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，俗称“打孔”，使DNA分子能够进入细胞内。CaCl2处理使感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。在细菌中能发展为感受态细胞占极小数，只有感受态的细胞才能稳定的摄取外来DNA分子。保持感受态的时间约12天，一般出现在生长对数期的后期。,两种假设：,.,5.DNA转化感受态细胞,（1）抗性琼脂板中抗生素的配制,.,感受态细胞新鲜配制的或从-80冻存取出后置于冰水中融化。取出分装到Eppendorf管中，每管100200uL。加入需转化的DNA溶液25ul充分混匀(15ug/mLDNA)。冰水中放置30分钟。37或42水浴2分钟。(热休克)冰浴2min。每管再加入1mLLB培养基，37振荡培养1小时。取出后稍加离心，去掉部分上清，留500uL或250mLLB则全部铺板。,（2）转化步骤,.,取100200uL，置于有选择性标记的琼脂培养皿上，用无菌玻璃棒涂匀；静置510分钟。倒置37培养1218小时(一般过夜)；次日，挑选单菌落，扩增，提取DNA酶切，电泳检测，筛选重组子。并设下列对照：A不加需转化的DNA溶液（用蒸馏水或LB培养基代替）。B用普通LB琼脂平板代替有选择性标记的琼脂平板。DNA超螺旋转化最好DNA环状次之DNA线状有干扰作用1ugpBR322DNA转化入HB101可得：5106/2107转化子。DNA分子量小比分了量大的转化率高，一般不超过10kb，最高限为15kb。一般1ugDNA可得51071108个转化菌。,.,（3）注意事项,宿主菌取出时应注意菌株名及编号。检查宿主菌，应无质粒污染，无抗菌素抗性。整个操作过程应保持无菌状态。LB培养液中不能有抗生素。不同受体菌，培养要求不同。如K802株，OD550=0.5最好，而X1776株，OD550=0.20.3最好。质粒的DNA比较小，有助于其转于宿主细胞中的效率。转化效率与质粒大小成反比。而质粒大于15kb时，转化率成为限制因素。同时质粒大，复制的拷贝数低。,.,（4）质粒的三种构型,超螺旋闭合环状DNA，cccDNA。开环DNA，至少一股DNA上有缺口，一处或多处使DNA鲜旋。线状DNA琼脂糖(Agrose)电泳可将这三种构型的DNA分开，Agrose电泳中cccDNA位置最前。,.,二、阅读微生物的基因型符号,在描述一个微生物的品系时，最重要的事就是区分它的基因型和表现型。基因型说明它的遗传决定子，这是看不见的特性；而表现型反映的是可观察到的特性。1由于一个微生物的基因组中有成百个基因。因此，一般而言，在描述一个品系的基因型时只给出它与野生型有所不同的等位基因，而不必一一描述那些与野生型相同的基因。也就是说，在它们名称后面所给出的是这些品系的基因组中发生了突变的基因。如：某菌，trp、his和metA，是表示它的trp、his和metA基因座是突变了的，其他基因组仍然正常。在上下文贯通地具体描述微生物的某个基因(如trp)时，可以用trp+，或者只是简单地用“+”表示它的野生型品系，而不必在每次提到它时都写作trp+。有些突变型是缺失突变，就用表示，如lon表示lon基因的缺失突变。,.,2有些细菌中有附加体或者其他特殊的传导噬菌体。最常见的是性因子F。细菌中有F因子的描述为F+；没有的为F-。有些F因子上面带有细菌的某些基因，这样的F因子写作F，它所带基因的描述方法同上。例如Flac+，proA+，B+表示F因子上面带有细菌的lac和proA，B基因。又如，FlacZ，proA+，B+表示F因子上面带有lac和proA，B基因，但是，其中的Z基因是突变的基因。3校正基因(sup)座位的描述常常令人眼花缭乱。因为野生型品系虽然不带有校正基因，它的基因型却理所当然地应当写作sup+，表现型则应该写为Sup-。可是，带有sup基因的突变型品系的基因型必需写为sup-或者sup，它的表现型是Sup+。也就是说，字面上的概念与实际上的情况正好倒了一个个儿。因此，在阅读它时要特别小心，以免搞错。此外，在谈到特殊的校正基因时，它的表现型常用数字来表示，如Sul；但是，它的基因型却用字母来表示supD。鉴于这种情况，有人建议对校正基因野生型(Su-)的品系干脆不用任何符号，只标出突变型品系(Su+)的特殊基因座位符号，如supD和supE等。,.,JM83，F-，ara，(lac-proAB)，rpsL，80d，lacZM15是这样一个品系：不带F因子，ara基因座突变(因此不能代谢阿拉伯糖)，lac操纵子缺失(因此不能利用乳糖)，30S核糖体的S12亚基突变(因此有链霉素抗生)，-D-半乳糖苷酶基因部分缺失(因此在含X-gal的平板中有-互补作用。如果将克隆的pUC质粒的重组DNA转化入这个细菌，就可以通过蓝/白菌斑来筛选出转化子)。野生的大肠杆菌具有大约4700kbp的DNA分子，上面有约2800个基因。当这些基因中有突然变异发生时，基因产物随之变化，并且有可能给大肠杆菌带来可以观察到的变化。这种能够观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型(Phenotype)，而把基因的构成叫做大肠杆菌的基因型(Genotype)。,试举一例来说明上述概念：,.,通常情况下，基因工程中使用的大肠杆菌的基因型只有在基因发生变异，表现型发生变化时才被表示。但是需要特别的表示时，则在野生的基因型上加“+”，在变异的基因型上加“-”以示区别。表示方法是用基因产物或其作用的名称的三个斜体字素表示(如DNAAedninemethylase-dam)。如果不同的基因变导致相同的作用结果，则加上一个大写字母(如Recombination-recA、recB、recC)。某个基因或者是某领域缺失时，在基因型前向加上“”表示，如“从lac到proAB基因缺失时表示为(lac-proAB)。野生的大肠杆菌本来还有具有F因子等的质粒DNA，并且感染噬菌体。把被野生的大肠杆菌感染的噬菌体特称为原噬菌体(Prophage)，例如e14。一般当这些质粒或原噬菌体缺失或变异时也用“()”或“/”等加以区别表示。,.,表现型是用罗马字母体表示(第一个字母大写)。一般通过变异而获得了能够观察到的抗药性或者活性表达等特征时，用“+”表示(Steptomycin抗性：Str+)；相反地当成为药物敏感性或者活性丧失时，用“-”表示(Ampicillin敏感性：Amp-)。基因型表现容易混淆，使用时注意。*基因工程中经常使用的大肠杆菌几乎都来自于K-12菌株，最近也常使用由B株及C株来源的大肠杆菌。*大肠杆菌B株原来就为lon-，另外MV1184株不具有琥柏抑制基因(Ambersuppressorfree)，由于这些都是原始菌株所不具备的基因，因此不在基因型中加以表示，要注意。,.,supE(suppressor)抑制基因supE变异时，即使存在终止密码UAG，此处也会插入谷氨酰胺(Glutamine)，从而可使蛋白质继续合成。supF(suppressor)抑制基因supF变异时，即使存在终止密码子UAG，此处也会插入酪氨酸(Tyrosine)，从而可使蛋白质继续合成。,停止密码回复,.,recA(recombination)重组相同的DNA重组活性缺失由于导入DNA与宿主DNA的重组受到阻害，可以保持插入DNA的稳定性。与recA13宿主菌相比，recA1宿主菌能够使插入DNA稳定存在。recB，C(recombination)重组内切核酸酶V变异。抑制重组并能影响放射线损伤的修复。traD(transmissibility)遗传稳定性在质粒F因子内部，与大肠杆菌的结合有关。TraD变异后，F因子自身的传递能力显著下降。,重组机能缺失,.,dam(DNAadeninemethylase)DNA腺嘌呤甲基化酶宿主菌来源的腺嘌呤甲化酶(GmATC)缺失dcm(DNAcytsinemethylase)DNA胞嘧啶甲基化酶宿主菌来源的胞嘧啶甲基化酶（CmCWGG）缺失hsdR(hostspecificitydefective)宿主特异性缺陷宿主菌来源的I型限制酶Ecok(或EcoB)的切断部位蛋白变异转化的外源DNA不被限制酶EcoK切断，可以进行克隆hsdM(hostspecificitydefective)宿主菌来源的I型限制酶EcoK(或EcoB)的甲基化酶部位蛋白变异hsdS（hostspecificitydefective）宿主菌来源的I型限制酶EcoK(或EcoB)的识别部位蛋白变变异转化的外源DNA不被限制酶EocK切断，可以进行克隆,对插入DNA具有直接作用因子的缺失,.,endA(endonuclease)内切核酸酶宿主菌来源的非特异性内切核酸酶I活性缺失，可以提高纯化的质粒DNA的质量。NcrA(methylcytsinerestriction)mCG序列的甲基化活性缺失。mcrB，C(methylcytsinerestriction)GmC序列的甲基化活性缺失。mrr(methylationrequiringrestricion)mA以及mC序列的甲基化活性缺失。,.,rpsL(ribosomalproteinsmallsubunit)由30S核糖体蛋白变异而获得链霉素(Steptomycine)抗性(Strr)。gyrA(gyrase)由DNA回旋酶亚基A的变异而获得的萘啶酮酸(Nalidxicacid)抗性(Nalr)。Tn5(transposon)转座子变异，获得卡那霉素(Kanamycine)抗性(Kmr)。Tn10(transposon)转座子变异，获得四环素（Tetracycline）抗性（Tetr）。,抗药性的变异,.,lon(longform)分解异型蛋白质的ATP依赖型蛋白分解酶活性缺失。大肠杆菌B株原来就为lon-。可抑制其表达的融合蛋白质的分解。omp(outermembranep