《中国药典》无菌检查修订内容.ppt

2005版中国药典无菌检查修订内容,天马行空官方博客：,一、起草指导思想二、无菌检查法概念三、增修订内容四、供试品的无菌检查,一、起草指导思想1、完善检查方法；2、增加实验的可操作性；3、缩小与先进国家药典的无菌检查法的差别；4、使方法更具科学性，以提高检出率，保证检验结果的可靠性。,二、无菌检查法概念系指用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。同时指出：若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现被微生物污染。,三、增、修订内容无菌检查法的设施、培养基名称、培养基无菌性及灵敏度检查、实验用菌株、最小检验量、培养基用量、方法验证、培养时间、结果判断等等。,1、无菌检查的设施试验环境应在洁净度10000级下的局部洁净度100级的单项流空气区域内或隔离系统中进行、其全过程必须严格遵守无菌操作。另规定：应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净级的检测。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。,隔离系统的应用应用隔离系统重要的两方面：一是保护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的污染，保证无菌实验结果的可靠性，实现一次检出的要求；二是保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来的污染。,天马行空官方博客：,2、培养基的命名硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌和厌氧菌）改良马丁培养基（用于培养真菌）选择性培养基增加1种，中和剂和表面活性剂要经验证,3、培养基的制备方法培养基可按处方制备，亦可使用按该处方生产的提供符合灵敏度试验的脱水培养基。硫乙醇酸盐流体培养基的装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度1/2。在供试品接种前，培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次。配制好的培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌。,4、培养基的贮存制备好的培养基应在2-25、避光保存；保存在非密容器中，应在3周内使用（一般指配制好的）；保存在密闭容器中，可在1年内使用（一般指商品化）。,5、培养基的适用性检查无菌性检查每批培养基随机取不少于5支（瓶），培养14天，应无菌生长。试验可与无菌试验同时进行。,灵敏度检查菌种：传代次数不得超过5代2005：金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）CMCC（B）26003铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）CMCC（B）10104生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）CMCC（B）64941枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)CMCC(B)63501白色念珠球菌（Candidasporogenes）CMCC（B）98001黑曲霉（Asperjillusniger）CMCC（F）980032000：藤黄微球菌（Micrococcusluteus）CMCC（B）28001生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）CMCC（B）64941白色念珠球菌（Candidasporogenes）CMCC（B）98001,菌液制备,天马行空官方博客：,天马行空官方博客：,培养基接种,试验菌培养基每管装量接种管数接种量培养时间(ml)(支)（ml）（天）金黄色葡萄球菌硫乙醇酸盐12213铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠球菌改良马丁培养基9215黑曲霉1支不接种作为空白对照接种量1ml含菌100cfu,结果判断空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。试验同时应做空白对照,6、稀释液、冲洗液0.1%蛋白胨水溶液pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液如需要可加入表面活性剂或中和剂应经方法验证证明其有效性，并对细菌存活无影响。修改原因：增加检出率，使受损的微生物复苏,7、方法验证当建立药品的无菌检查方法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证，并对每一试验菌应逐一进行验证。,菌种及菌液制备同培养基灵敏度试验方法方法验证方法培养基接种菌加菌量接种管数培养（cfu）（支）（天）直接接种法硫乙醇酸盐金黄色葡萄球菌10023-5铜绿假单胞菌生孢梭菌枯草芽孢杆菌改良马丁白色念珠球菌10023-5黑曲霉薄膜过滤法同直接接种法,直接接种法取规定量培养基分别接入小于100cfu的试验菌（6种菌），其中1管接入规定量供试液，另一作为对照。,薄膜过滤法将规定量供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积相同培养基的容器，加入同量试验菌，作为对照,结果判断如含供试品各管中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用。按此法进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。应采取措施，消除供试品的抑菌作用。并再重新进行验证试验,四、供试品的无菌检查法无菌检查方法包括直接接种法和薄膜过滤法。如供试品允许应优先采用薄膜过滤法.,1.阳性对照试验应根据供试品的特性选择阳性对照菌。无抑菌及抗革兰氏阳性-金黄色葡萄球菌抗革兰氏阴性-大肠埃希菌抗厌氧菌-生孢梭菌抗真菌-白色念珠菌阳性对照培养48-72h应生长良好。2.阴性对照应取相应溶剂和稀释剂同法操作。阴性对照不得有菌生长。若使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等，应证明其有效性，且对微生物生长及存活无影响。,3.检验数量指一次检验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，参照表1、2、3。最少检验数量不包括阳性对照试验用量，也不包括验证试验用量。一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品1支（或瓶）作阳性对照用。,4.检验量指一次试验所用供试品总量（g或ml）。除另有规定外参照表2、3。若每支（瓶）供试品装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量不应少于直接接种法的总量，只要供试品的特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤.,5.检验方法薄膜过滤法过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤也可使用一般薄膜过滤器。选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。冲洗液的量不宜过大，避免滤膜上的微生物受损。,水溶性供试品可溶于水的固体制剂供试品-内酰胺类抗生素供试品非水溶性制剂供试品可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品检查方法无菌气（喷）雾剂供试品装有药物的注射器供试品具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）供试品,（2）直接接种法供试品按规定量分别接入含培养细菌和真菌培养基的容器中，除另有规定外，每个容器中的培养基量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%。同时硫乙醇酸盐培养基不得少于15ml、改良马丁培养基不得少于10ml，培养基用量和高度同方法学验证试验。,混悬液等非澄清水溶液供试品固体制剂供试品-内酰胺类或磺胺类供试品非水溶性制剂供试品敷料供试品肠线、缝合线供试品灭菌医疗器具供试品放射性药品,6、培养及观察培养14天，如果培养基浑浊或培养14天后从外观不能判断是否长菌，可取该培养液适量转种至同种培养基或斜面上，培养细菌2天、真菌3天，观察有无菌生长或镜检进行判断。阴性对照不得有菌生长。,7、结果判断若供试品管均澄清，或虽显浑浊但证明无菌生长，判供试品符合规定。若供试品中任何1管显混浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定。除非能充分证明，生物非供试品所含。当符合下列少一个条件时，方可判试验结果无效。,对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。回顾无菌实验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；阴性对照管有菌生长。供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证微生物生长是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。,试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定，若有菌生长判供试品不符合规定。,出厂产品批最小检验数量,上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量,上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量,每种培养基各接种10支供试品。桶装固体原料的最小检验数量为4个包装。,菌种验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），以保证试验菌株的生物学特性。应采用适宜的保存技术，防止试验菌株发生变异。,菌种的收集、贮藏、保存、确认试验的记录。1、溯源性(菌种的来源)：药品微生物实验室的标准菌种应来自中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（ChinaMedicalCultureCollectionCMCC）系列。或美国药典收载的美国菌种保藏中心（AmericanTypeCultureCollectionATCC）系列等国际法定菌种保藏中心。,2、菌种的质量控制：对选择性培养基上培养的典型菌落进行鉴定。形态、染色镜检、纯度、必要时应做生化鉴定试验，一旦出现偏差，应做进一步的调查，所有被确认受到污染或变异的菌种应及时销毁，不得用于常规实验用。,3.菌种管的标签要求：名称、编号、代数、有效期、制备日期菌种记录：名称、编号、来源、菌落形态特征、培养特性、生化与血清学鉴定、传代数、培养基及培养条件、保藏方法、贮存条件及保藏库址。,4、菌种的保存对微生物实验来说菌种是特殊的标准品应给予相同于化学标准品的管理（溯源性、质量的原始性）外，还有安全性方面的管理。菌种保藏方法有多种，但对不同的微生物应通过保藏试验来选择最适宜保藏方法。一般多用琼脂斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、冷冻真空保藏法、甘油冷冻管保藏法等。,琼脂斜面低温保藏方法实验室多采用此法一般在4保存。铜绿假单孢菌在室温保存。,液体石蜡保藏法本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理、升化水平，延长菌种保藏时间。方法：液体石蜡121高压灭菌30min或110-170烘箱1-2h干燥去掉水分。取经培养的高层半固体菌管加入石蜡，高出培养基面1cm为宜，放入4保藏。,冷冻真空保藏法保护剂多种多用脱脂牛奶。将牛奶煮沸、静止、冷却除去上面一层脂肪，重复3次用脱脂棉过滤，113高压灭菌30min，接入菌种，培养后低温、冷冻、真空干燥置-35保存。,（4）甘油冷冻管保藏法将待保藏菌接种平板或琼脂斜面，适宜温度下培养适宜时间后（细菌2448小时的培养物，白色念珠菌72小时的培养物。