2.1 微生物的实验室培养(2).ppt

专题2微生物的培养与应用,课题1微生物的实验室培养(2),课堂讲义重点难点个个击破,一、培养基的制备1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基计算：依据牛肉膏蛋白胨培养基配方比例计算配制100mL的培养基时，各种成分的用量称量：牛肉膏比较黏稠，可用玻璃挑取，称量纸称取，牛肉膏和蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖,溶化：牛肉膏和称量纸水取出称量纸加蛋白胨和氯化钠加琼脂(注意：不断用玻璃棒搅拌防止糊底而导致烧杯破裂)补加蒸馏水至100mL,倒平板：待培养基冷却至50左右时，在酒精灯火焰附近倒平板,2.注意事项(1)用天平称量时，注意放等大的称量纸，防止牛肉膏粘在托盘上。(2)在溶化时要用玻璃棒不断搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。(3)培养基灭菌后，需冷却至50左右时才能倒平板，原因是琼脂在44以下凝固。(4)培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开。(5)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。(6)平板冷凝后要倒置的原因：防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。(7)若倒平板时，培养基溅在皿盖和皿底之间的部位，易滋生杂菌，这个平板应丢弃。,一、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.用文字和箭头写出制备流程：。2.倒平板是制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的重要环节，如图为倒平板的操作示意图。(1)请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：。(2)甲、乙、丙中的灭菌方法是。(3)丁中的操作需要等待才能进行。,答案,预习导学挑战自我点点落实,平板冷却凝固,计算称量溶化灭菌倒平板,丙乙甲丁,灼烧灭菌,二、微生物的分离与纯化技术1.原理微生物的分离与纯化就是将待检测微生物样品通过划线或涂布接种在固体培养基上，样品中的每一个细胞或孢子都可以生长繁殖形成单个菌落。将单个菌落接种到斜面培养基上，经培养后，即可得到一个微生物的纯种。,2.方法步骤微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤。(1)梯度稀释操作(如图1)将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按101106的顺序编号。用移液管吸取1mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰12cm处。,图1微生物分离操作流程图,(2)划线或涂布平板划线法：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线，常用的划线方法有平行划线和连续划线两种。平行划线时，每转一个角度烧一次接种环。划线完毕后，盖上培养皿盖，做好标记(如图2)。图2划线示意图,稀释涂布平板法：取3个平板，底面分别用记号笔写上104、105和106三种稀释度，然后用无菌吸管分别吸取相应稀释度的稀释液各0.1mL，放入已标记好的平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置510min，使菌液吸附进培养基(如图3)。图3涂布法示意图,(3)培养将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37恒温箱中，培养12h和24h后，分别观察并记录结果。(4)结果分析确认培养基制备是否合格为确认培养基制备是否合格，需设置对照实验，即接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37恒温箱中，培养12h和24h，观察现象并记录如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则实验失败需要重新制备。,接种操作成功的标准如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合该菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中无菌操作还未达到要求，实验失败，需要分析原因，再次制备。,答案,二、纯化大肠杆菌1.接种微生物的方法最常用的有和。2.右图中甲为平板划线法中最重要的环节，乙为操作的结果。每一次划线后要将接种环，除第一次划线外，每一次划线的起点是，最后一次划线不要和相连。3.稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到的表面进行培养。只要，就能在培养基表面形成单个的菌落。,稀释度足够高,平板划线法,稀释涂布平板法,灼烧,上一次划线的末端,第一区域,梯度稀释,琼脂固体培养基,答案,三、菌种的保藏对于频繁使用的菌种，可以采用法；对于需要长期保存的菌种，可以采用法。,甘油管藏,临时保藏,预习诊断,判断正误：(1)在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的过程中，所用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法()(2)将培养基从干热灭菌箱内取出立即就可以倒平板()(3)平板划线法和稀释涂布平板法都要在固体培养基上操作(),返回,答案,答案,思维激活,1.请简述制备牛肉膏蛋白胨固体培养基过程中的几次灭菌过程。,答案(1)对培养皿进行干热灭菌；(2)对制备成的培养基进行高压蒸汽灭菌；(3)倒平板过程中的灼烧灭菌(酒精灯火焰进行操作)。,2.等平板冷却凝固后要将平板倒置，请简述倒置的原因。,答案平板冷却后，皿盖上会有凝结的水滴，且培养基表面的湿度较高，平板倒置后，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水滴滴入培养基造成污染。,应用示例,1.制备各种牛肉膏蛋白胨固体培养基，关于倒平板的具体描述正确的是()待培养基冷却至40左右时，在酒精灯火焰附近倒平板将灭过菌的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰用左手的拇指和食指完全打开皿盖右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖等待平板冷却510s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上A.B.C.D.,解析答案,问题导析,问题导析,(1)培养基灭菌后，需冷却至左右时才能倒平板，原因是琼脂在44以下凝固。(2)倒平板的过程要在附近进行。,答案,返回上页,酒精灯火焰,50,解析琼脂是一种多糖，在98以上可溶解于水，在44以下凝固，倒平板时高于50则会烫手，低于50时若不能及时操作，琼脂会凝固。无菌操作应贯穿于操作的全过程，皿盖全打开则空气中的微生物会进入培养基。等待平板冷却凝固(大约需510min)后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。答案C,一题多变,倒平板的过程需要进行无菌操作，在培养基的制备过程中，还有哪些环节需要进行无菌操作？,答案要对培养基进行高压蒸汽灭菌，对培养皿进行干热灭菌，酒精灯火焰旁属于灼烧灭菌。,答案,思维激活,1.稀释涂布平板法要求菌液的稀释度要足够大，平板划线法要求连续多次划线，且除了第一次划线外，每一次划线的起点是上一次划线的末端，两种操作方法虽然不同，但目的相同，该目的是什么？,答案目的是将菌种充分地分散，保证菌落是由一个细胞或孢子繁殖而成，所获得的菌落中的菌种是单一的纯种。,答案,2.平板划线法中的接种环要进行多次灼烧(取菌液前的灼烧、每一次划线后的灼烧及划线结束后的灼烧)，请简述每次灼烧的目的。,答案取菌液前灼烧的目的是避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每一次划线后的灼烧的目的是杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种都来自上次划线末端；划线结束后的灼烧杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,答案,下列叙述中，错误的是()A.甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液B.对于浓度较高的菌液，如果甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不是由单一的细胞或孢子繁殖而成C.乙中培养皿中所得的菌落都符合要求D.乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端,应用示例,解析答案,问题导析,2.右图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法操作结果。,问题导析,(1)对菌液进行稀释时，菌液中的菌体的浓度越高，则稀释的倍数也要_，菌体的浓度低时，则稀释的倍数不必。(2)高温会杀死菌体，所以一些经过高温或灼烧灭菌的器材需要后才能接触菌种。(3)平板划线法的多次划线中，菌体_，即不同划线处的_不同，所以形成的菌落并非全部是由单个菌体繁殖而成的。,答案,返回上页,菌体数目,越高,太高,冷却,越来越少,解析灼烧后的接种环如果没有冷却就接触菌种，会将菌体杀死，A正确；稀释倍数过低，会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落，B正确；平板划线法中最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，C错误；连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起点是上一次划线的末端，目的是使得菌体密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢子繁殖而成。答案C,一题多变,(1)两种接种方法中，如果操作均正确无误，只有稀释涂布平板法才适合对细菌进行计数而平板划线法不能，请简述原因。,答案只要稀释倍数足够高，则稀释涂布平板法中形成的每个菌落都是由单一菌体繁殖而成的，即一个肉眼看不见的细菌对应着一个可以看见的菌落，可以通过统计菌落的数目推测出细菌的数目。而平板划线法中除了最后一次划线末端处的菌落是由单一的细菌繁殖而成的，其他每个菌落往往是由多个细菌一起繁殖而成，即一个菌落并非对应着一个细菌，所以不适合用于细菌的计数。,答案,(2)稀释倍数和划线次数是两种接种方法的关键，决定稀释倍数和划线次数的因素是什么？,答案决定稀释倍数及划线次数的因素是菌液的浓度，如果菌液的浓度较高则需要高倍数的稀释，所划线次数也要较多，否则就可以低倍稀释或减少划线次数。,答案,课堂小结,返回,答案,称量,对点练习,1,2,3,4,解析答案,1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是()A.计算、称量、倒平板、溶化、灭菌B.计算、称量、溶化、倒平板、灭菌C.计算、称量、溶化、灭菌、倒平板D.计算、称量、灭菌、溶化、倒平板,解析制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，应先根据需要计算各成分用量，然后称量、溶化、灭菌、倒平板。,C,1,2,3,4,解析答案,2.平板冷凝后，要将平板倒置，其原因是()A.接种时再拿起来方便B.在皿底上标记日期等方便C.正着放置容易破碎D.防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染,解析平板倒置主要是防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。,D,解析答案,3.分离纯化大肠杆菌最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。下列有关这两种方法的叙述错误的是()A.均将大肠杆菌接种在固体培养基的表面B.获得的每个菌落均是由一个细菌繁殖而来的子细胞群C.都应在火焰附近进行操作，以防止杂菌污染D.稀释分散菌种的原理不同，均能达到分离纯化大肠杆菌的目的,解析用稀释涂布平板法时，如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能是由一个细菌细胞繁殖形成的。平板划线中最后一次划线的末端处开成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖形成，这种菌落才符合要求。,B,1,2,3,4,1,2,3,4,4.右表是从土壤中分离纯化土壤细菌的培养基配方。请回答下面的问题。,解析答案,(1)培养基的类型很多，但培养基中一般都含有水、碳源、和无机盐。上述培养基配方中能充当碳源的成分是。培养基配制完成以后，一般还要调节pH并对培养基进行处理。,解析培养微生物的培养基中一般含有水、无机盐、碳源、氮源和生长因子。牛肉膏、蛋白胨既是碳源又是氮