实验二沉淀反应.ppt

实验二沉淀反应,一、实验内容,1.双向琼脂扩散试验(小组做),2.单向琼脂扩散试验(示教),3.免疫电泳(示教),4.火箭电泳(示教),5.尿液HCG检测(胶体金免疫法),(小组操作),免疫标记技术,沉淀反应,6.录像：免疫反击战,二、目的与要求,1.掌握单扩、双扩基本原理、方法、结果分析及应用。2.熟悉免疫电泳基本原理及应用。3.了解火箭电泳基本原理及方法。4.认识示教单扩、火箭电泳和免疫电泳的染色片的图形。5.了解胶体金免疫法检测HCG的原理、方法。,三、讲解内容,（一）沉淀反应的定义,指可溶性Ag与相应Ab在一定条件下发生特异性结合，出现肉眼可见的沉淀物的反应。,可溶性Ag沉淀原；相应Ab沉淀素。,沉淀反应与凝集反应的比较,抗原性质反应物稀释对象不同凝集反应颗粒性抗原凝集物稀释Ab(振摇后不浑浊)(试管凝集)沉淀反应可溶性抗原沉淀物稀释Ag(振摇后浑浊),（二）沉淀反应的类型,根据Ag和Ab扩散的介质不同分为两大类：,1.在溶液中进行扩散环状沉淀试验。,2.在琼脂中进行扩散琼脂扩散试验：单扩、双扩、火箭电泳、免疫电泳等。,1.环状沉淀试验（介绍）,用途：用于法医学鉴定和昆虫嗜血性鉴定。,2.双向琼脂扩散试验,原理：琼脂凝胶是一种半固体胶状物，里面有无数小孔，Ag、Ab在孔中进行扩散，在比例适合处形成沉淀线，即为阳性反应。,双孔型：Ag、Ab分子质量分析。,三角型：Ag性质分析,梅花孔型：Ag/Ab效价的滴定,双向琼脂扩散试验用途：抗原或抗体的检测，定性或可粗略定量。缺点：需时长，灵敏度不高。,3.单向琼脂扩散试验（示教）,用途：已知抗体测抗原，定量实验；缺点：耗时长。,1:10,1:20,1:40,1:80,Ag稀释度,4.免疫电泳（示教）,先Ag电泳，后扩散。注意：1、2孔为Ag样本孔。,免疫电泳的用途：,A.用于某种蛋白缺乏的疾病的诊断；,B.用于抗原纯度的定性分析。,5.火箭电泳（示教）,用途：已知抗体测抗原，定量实验；,火箭电泳单向琼脂扩散电场,优点：耗时短，反应敏感性好。,四、操作内容1.甲胎蛋白(AFP)的检测（小组操作）（1）材料：A.待测Ag：AFP可疑血清；B.阳性对照：AFP阳性血清；C.阴性对照：生理盐水（NS）D.已知抗体：兔抗人AFP。,（2）方法及步骤：,A.琼脂反应板制备；,B.打孔；,C.加样；,D.反应(湿盒3724h)；,E.结果分析。,(已知Ag),(已知Ab),（阴性对照）,*1:32与1:16相吻合1:16与1:8相吻合1:8与AFP(+)相吻合,标本中抗原为AFP抗原,*1:32有沉淀线1:64无沉淀线,标本中抗原滴度为1:32,E.结果分析。,（5）注意事项：,A.打孔不要划破边缘；,B.加样不宜过多，不要溢出；,C.反应时间为24h；,D.合理分配吸管，Ag、Ab吸管不能混淆。,2.胶体金免疫法检测尿液HCG,人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin,HCG),受精卵移行到子宫内着床后，形成胚胎，在胚胎的发育过程中，胎盘合体滋养层细胞产生大量的HCG，是一种具有促性腺发育的糖蛋白类激素,可通过孕妇血液循环而排泄到尿中。HCG作为抗原，可以用已知特异性抗体检测尿液中的HCG以诊断早孕。,胶体金免疫法实验原理,胶体金是由氯化金与还原剂反应形成的一种胶体颗粒，具有吸附蛋白质的特性(可以标记Ag或Ab)。胶体金颗粒聚集到一定大小后即呈现出红色。,早早孕HCG胶体金试纸,采用了双抗体夹心法的检测模式。,1.鼠抗人HCG单抗(固定的检测线),2.羊抗鼠IgG(固定的质控线),尿中HCG与金标记的鼠抗人HCG结合形成免疫复合物；随层析作用向上移动,至检测线与鼠抗人HCG抗体结合而聚集显色,HCG金标试纸,带条中含有均匀分布的胶体金标记的鼠抗人HCG单抗,在检测线未结合的金标记鼠抗人HCG单抗(IgG)随着尿液上行,到达质控线与羊抗鼠IgG(二抗)结合而显色，作为质控对照。,标志线,带条中含有均匀的胶体金标记的鼠抗人HCG单抗,1.鼠抗人HCG单抗,2.羊抗鼠IgG（二抗）,胶体金免疫法与放射免疫测定法、ELISA等方法相比,具有的优点：,1.胶体金法不需ELISA法中所要求的作用的底物和显色剂，操作更简便；,2.胶体金法无污染，不危害操作者，也不污染环境；,3.胶体金标记抗体在冻干状态下室温储存较稳定,有效期长；,4.灵敏度高，10-25IU/L。,完成实