第五章双向凝胶电泳(2D-PAGE)

.第五章双向凝胶电泳(2D-PAGE )、蛋白质组学技术路线双向凝胶电泳技术的发展和原理仪器介绍样品制备技术流程1 .蛋白质组学技术路线、要求工艺技术路线、蛋白质组学的首要要求是分离、检测、检测全细胞、组织或生物体中的数千种混合蛋白质、生物学问题提出、实验模型设计、实验组和对照组样品制备、蛋白样品IEF和PAGE电泳分离、图像扫描和初步分析、兴趣蛋白点切分、胰酶消化脱色后蛋白质、质谱多肽指纹图、微序列分析、 与质谱分析结果的生物信息学分析进行比较，发现新蛋白质，其他实验的进一步验证蛋白信息的初步获得，蛋白组分析过程，蛋白组研究的基本技术途径，蛋白样品的制备，双向电泳，图像分析，转录到膜上的蛋白，凝胶中的蛋白，溶液中的蛋白， 混合肽，蛋白质质量，n末端序列分析，肽序列质谱数据，肽指纹图，数据检索，新的或已知蛋白，蛋白转录后修饰的鉴定，、2 .双向电泳技术的发展和原理、双向凝胶电泳发展的基本原理、双向凝胶电泳的发展、 双向凝胶电泳的构想是Smithies和Poulik提出的Poul kmd.two-dimentityallelectrophoresisofserumproteins.nature，1956， 177:033 )蛋白质最初的电泳基于其自由溶液迁移率(free-solutionmobility )在滤纸条上进行的第二方向的电泳方向与第一方向垂直，在淀粉糊上进行。 之后， Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳的双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶的kenrickg.two-dimentityalrresortionofplassmottinsbycomminitionofpolyac radentgelectrophoresis.nature，1969，2213360056-1057 )是双向凝胶电泳(two-dimensionalpolyacrylamingelelectrophoresis，2DPAGE )。 同年，二维2DPAGE在原理上有了新的发展，从一开始就作为蛋白质等电聚焦的双向凝胶电泳技术，使用了IEF-PAGE(DaleG，latn eneral.ionelectricronficrotinserverpplotinsinaccralaymide MackoV，stegemann h.paminingofpoottoproteinsbycombiedlctroforgenersingandelectroperseidentifictionofvarietes.Hoppe-s eylerSZ physe 20世纪70年代初，第二向电泳使用十二烷基磺酸钠(SDS ) (barrettt，Gould HJ.tissuerendspecieespecificityofnon-histonechromatnproteins.biches ) MartiniOHW，gouldh.j.enumerationofbiticolityricocyteribosolproteins.jmol biol，1971，62336403-405； stegemann teinfraktoionigerungeninpolyacrylamidindieanwendungaufdiegenetischeanalysissebipflanzen.angewchem，1970，82:640 1975年，oFarrell、Klose和Scheele分别进一步优化了双向凝胶电泳， 建立了高分辨率双向凝胶电泳的klose tinmappagingbycomminedisectionelectriconselectringandelectroprosesssofthonvellappachtotingforindepontt o-dimentionallelanalysisofsolumbleproteins.jbiolchem，1975，2503360375-5385 )。 该技术是目前能同时分离展示数千种蛋白质的唯一分离技术，一般能分离1000-3000个蛋白质点，最高凝胶能分离11000个左右的蛋白质点。 双向凝胶电泳的基本原理是，蛋白质根据其等电点在pH梯度凝胶内等电聚焦，然后根据相对分子质量的大小进行SDS-PAGE的第2次电泳分离。一直以来都进行等电聚焦(isoelectricfocusing，IEF )，蛋白质具有两性解离和等电点特性，因此将蛋白质样品放置在pH梯度介质上进行电泳时，蛋白质样品向与其带电的电荷相反的电极方向移动。 在迁移过程中，蛋白质分子可能会获得或失去质子，随着迁移，其蛋白质所具有的电荷数和迁移速度降低。 蛋白质移动到其等电点pH位置后，净电荷数变为零，在电场中不再移动。 蛋白质向低于其等电点的pH区域扩散时，带正电荷，受电场的影响再次向阴极移动。 同样，蛋白质扩散到比其等电点高的pH区域时，带负电，通过电场向阳极移动。 不同的等电点使蛋白质最终聚焦在较窄的pH梯度介质区域。 目前，将预制带(IPG，immobilizedpHgradient )用于蛋白质的等电聚焦分离，使聚焦的IPG带在含有SDS的缓冲液中平衡。 第二个方向是将最先被IPG凝胶分离的蛋白质转移到SDS-PAGE凝胶中，根据蛋白质的相对质量和分子量(MW )的大小与最初的方向垂直分离。 垂直方向进行SDS-PAGE电泳，按分子量的大小分离。 样品分离电荷和质量两次后，得到等电点和分子量的信息。IPG凝胶的材料为Immobilines，是具有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，r含有羧基或叔氨基，构成分布于pH310不同值的缓冲体系。 按公布处方计算后，将合适的IPG试剂加入混合物中用于凝胶聚合，聚合过程中缓冲基团通过乙烯键与聚丙烯酰胺骨架共价聚合形成pH梯度。 这样生成的IPG没有电渗作用，特别是稳定的IEF分离成为真正的平衡状态。三种双向凝胶等电聚焦系统根据一级电聚焦条件和方式，可以将双向凝胶电泳分为ISO-DALT、NEPHGE和IPG-DALT三类系统。 在ISO-DALT系统中，等电聚焦在聚丙烯酰胺管凝胶中进行，载体两性电解质在施加电场的作用下形成pH梯度，pH梯度在碱性区域不稳定(阴极漂移)，重现性难以掌握，主要缺点是样品量低， 一般来说，不能分离等电点大于8.0的碱性蛋白质的优点是电泳设备的要求不高，电泳溶液的制备容易，工作容易，各种电泳条件优化后，可以达到非常高的分辨率，重现性，从而识别目前10000个蛋白质的斑点NEPHGE为非平衡pH梯度电泳(nonequilibrimphgradientelectrophoresis )，是在发明IPG(immobilizedpHgradient )凝胶之前分离碱性蛋白质的一种方法，蛋白质在等电聚焦场下平衡IPG-DALT最初的电泳是采用1982年发明的IPG凝胶的methodologyandsomeapplications.jbioiohembiphysmethods，1982， 63336537-339 )是ph梯度的形成依赖于不同pK值的合成化合物immobiline，该化合物是丙烯酰胺的衍生物，非两性弱酸和弱酸，在凝胶聚合过程中可与聚丙烯酰胺共价键合，因此IPG凝胶的ph梯度稳定，不依赖于施加电场、非改性2D-PAGE :两个方向均在非改性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量与生理条件下得到的这些蛋白质的值相同的非改性/SDS-2D-PAGE :首先采用非改性IEF，然后用2%SDS溶液取得平衡的第二方向适用于分析非共价键结合的蛋白质之间的相互作用。 非改性/还原/SDS-2D-PAGE :在非改性条件下聚焦于IEF，然后用8M尿素5%-ME 2%SDS取得平衡，进行第二方向SDS-PAGE电泳.此时分离的蛋白质点可以进行点切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鉴定，提供二硫键被切断的多肽的相关信息。 改性2D-PAGE :样品首先在2%SDS 5%-ME 95下进行改性5min，IEF在8M尿素1%NP-40下进行，然后橡胶条件在2%SDS 5%-ME下平衡，进行SDS-PAGE . 该技术适用于分析DNA序列和多肽结构，分析碳氢键和其他翻译后修饰的多肽结构的微异质性，但该方法表明100KD以上的蛋白质点少于第三方法。 双向电泳分类，3 .设备介绍，第一：使用帕尔贴温度控制聚焦平台的最大电压为10， 000伏有不同的电压上升方式。可以分阶段进行，或者在电压小的情况下可以控制的再发泡膨胀可以采取整体或者独立的步骤，程序总是可以控制的同时24根7cm， 有3个预设步骤可以聚焦12条17cm磁带。10个用户可以自定义。收集运行数据可以通过RS232端口输出，也可以使用热敏记录纸。BIO-RAD公司PROTEANIEFCell等电集光器：AmershampharmciaBiotech公司IPGphor等电集光器：电极区域为镀铜板； 最多12个样品平台温度为18-251； 橡胶条沟(Holder )本身是氧化铝陶瓷，适合作为丙烯酸的盖的7、11、13、18cm的胶带程序参数是再发泡时间、平台温度、每条胶带的最大电流、每步的电压、每步的电流变化模式， 可以编辑10个程序，包括每个步骤的时间，每个程序有9个步骤。电压输出最大为8000V最大电流为1.5mA，最大功率为12W。第二方向：BIO-RAD公司PROTEANIIxiCell电泳槽：电极为直径0.01英寸铂电极，适用于16.520cm凝胶电泳的凝胶的厚度为1.0mm； 可同时运转12枚胶水，上槽缓冲溶液350ml，下槽缓冲溶液1.2L； 典型的SDS-PAGE电泳时间：无冷却5小时，带冷却3.5小时。 组合电源为PowerPac1000 :进行电泳时，最大电压为1000V以下，最大电力为80W以下，最大室温为50以下。 AmershampharmciaBiotech公司EttanDALTIISystem:(1)该系统的电源控制为PowerSupply/ControlUnit :最大输出功率为200W温度控制范围为10-50的最大电压600V的最大电流1A。 (使用Gelcaster的灌浆模具：最大可同时填充25.520.5cm、厚度1mm的橡胶或14块均匀橡胶。 AmershampharmciaBiotech公司hoefetminiveelectrophoresisandelectrotransferunit :浆糊的大小为10.08cm； 最多可同时运行2张胶水。运行1张胶水需要1.7L的电极缓冲液，运行2张胶水需要1.2L的电极缓冲液，最大电压为600V，最大功率为25W的电源为electrophoresispowersuplyeps 301。图像分析软件：AmershampharmciaBiotech公司： imagemastertm2d version :5.0 bio-rad公司： PDQuesTM、4 .双向电泳分析中的样品均为溶解状态(包括大量疏水蛋白) 防止样品聚焦时发生蛋白质凝聚和沉淀。 防止样品制造过程中样品提取后发生化学修饰(酶性或化学分解等)。 彻底清除样品中的核酸和干扰蛋白。 尽量去除有干扰作用的高丰度或无关蛋白质，保证所研究的蛋白质的检测性。 样品的分级处理通过子细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可以降低样品复杂度，丰富低丰度蛋白质。 目前最简单有效的处理方法是采用分级提取，按样品溶解度进行分离。样品溶解是2de分离蛋白质最重要的因素之一。 1、样品中的非共价键蛋白复合体和聚合体被完全破坏，形成各个多肽的溶液(否则样品中结合牢固的蛋白复合体可能在2-DE中出现新蛋白点，相应地表示各个多肽点的强度降低)。 2 .溶解方法应