小RNA测序测序介绍(含miRNA测序原理及案例分析)

小RNA项目介绍 Outline 1. 小RNA测序概述 2. 小RNA测序标准流程 3. 后续分析（个性分析） 4. 案例分享 小RNA基础 小RNA是指在生物体中表达的，不编码蛋白，长度较短 （1830nt或40nt）的RNA分子，参与诱导基因沉默，参 与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调 控过程。 microRNA，简称miRNA，是目前功能研究较为透彻的一 类小RNA(2025nt)。miRNA通过与特定mRNA的结合调 节相应基因的表达，这些基因称为该mRNA的靶基因。 miRNA的结构及其形成 miRNA 长度(集中在22nt附 近）； 首位碱基多数是U， 是G的可能性较小； 24位点较少为U。 抑制调控抑制调控 miRNAmiRNA的调控作用的调控作用 剪切调控剪切调控 研究背景研究背景 多见于植物多见于动物 适用范围 模式物种，有参考基因组，miRNA数据库 注释较多，找出新miRNA，研究miRNA的 功能。 非模式物种，无参考基因组，miRNA数据 库注释较少，研究物种中存在的与其他物 种同源的miRNA。 Outline 1. 小RNA测序概述 2. 小RNA测序标准流程 3. 后续分析（个性分析） 4. 案例分享 小RNA测序技术简介 小RNA测序技术采用胶分离技术，收集样品中18-30nt或 18-40nt的RNA片段，利用高通量测序技术，一次性获得 单碱基分辨率的数百万条小RNA序列信息，依托强大的生 物信息分析平台，鉴定已知小RNA，并预测新的小RNA及 其靶标。 小分子RNA是生物体内一类重要的特殊分子，诱导基因沉 默，参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活 动的调控过程。 9 样品要求 样品类型：完整且无污染的总RNA； 样品需求量（单次）： 10 g； 样品浓度： 200 ng/l； 样品纯度：OD260/280= 1.82.2、OD260/230 2.0、28S:18S 1.5、 RIN 8.0、23S:16S 1.5(此项要求只针对原核生物)； 提取总RNA时请不要使用Qiagen等公司的过柱试剂盒，也不要使用 LiCl沉淀； 如果是使用mirVana miRNA Isolation Kit等试剂盒回收的 Rfam)known miRNA(miRbase) repeat exon intron的顺序进行注 释。 种类数 统计 4.新miRNA预测 对象：小RNA分类注释后尚存的无注释小RNA。 Unann tags 比对区域前后一定长度序列 1）二级结构; 2）Dicer酶切 位点; 3）能量。 Pre-miRNA 预测 5.(已知的与新的)miRNA的碱基偏好性 Tags TACGAAGTGCGGC TGCGCAAGTATGT TCAGCGAGTAGCT 不同长度的tags首位碱基偏好性 Tags上不同位点的碱基偏好性 miRNA有其序列特点，首 位是U（测序结果为T）， 长度为2123nt。 碱基偏好性可以验证得到的 miRNA。 miRNA表达差异分析 该步骤与RNA-Seq的差异表达分析完全相同。 对已知与新miRNA在各样品中的表达量进行假设检验， 计算p-value，并使用多重假设检验校正P值，得到错误发 现率（FDR）。 miRNA在两样品中的表达量差异倍数越大，FDR越小，表 明表达差异越显著。我们将差异倍数大于2倍，且 FDR0.001的miRNA作为差异miRNA（可以根据需要调 整）。 miRNA聚类分析 以各样品中miRNA的表达量为基础，进行聚类分 析和热图分析。与RNA-Seq表达谱测序中差异基 因表达模式聚类分析方法类似。 7.miRNA靶基因预测 序列互补，能量。（植物、动物需分开做） miRanda、Targetscan、Mireap、三程序交集 动物mRNA CDS3UTR5UTR AAAA miRNA 植物mRNA AAAA miRNA 紧密结合到CDS或UTR，引起mRNA降解片段互补到3UTR，抑制mRNA翻译 CDS3UTR5UTR miRNA-靶基因关系网络图 红色的圆角矩形代表在样品之间有差异表达的并且是老师关心的miRNA； 绿色的圆圈符号代表了样品之间有差异表达并且是老师关心的Gene。 红色的抑制线表示了miRNA和Gene的靶向关系。 8.miRNA靶基因相关分析 得到miRNA的靶基因后，可以用与RNA-Seq类似 的方法对这些基因的功能进行分析，如GO、 KEGG注释等；对于样品间差异miRNA，同样可 以对其靶基因进行GO、KEGG富集分析。 GO富集分析结果 结果：根据富集显著性排序的GO term及其包含的基因。 9.靶基因的pathway富集分析及结果 按同样方法找出差异miRNA的靶基因中富集的pathway。 圆点：反应物 方框：酶或效应分 子。 红绿各半的方框： 该酶的同源基因中 存在上调基因（红） 和下调基因（绿）。 Outline 1. 小RNA测序概述 2. 小RNA测序标准流程 3. 后续分析（个性分析） 4. 案例分享 样品间差异miRNA比较 找出多样品间差异基因的交集和并集，并绘制成VENN图。 寻找有生物学意义的特定基因集（如只在某两个样品中差 异表达的基因）。 趋势分析 数据来源：梯度样品，差异miRNA并集的表达 量数据。 所得结果：显著表达趋势及包含的miRNA。 Outline 1. 小RNA测序概述 2. 小RNA测序标准流程 3. 后续分析（个性分析） 4. 案例分享 案例案例-猪骨骼肌猪骨骼肌miRNA综合研究综合研究 Lijun Qin, Yaosheng Chen, Xiaohong Liu, Sanxing Ye, Kaifan Yu, Zheng Huang, Jingwei Yu, Xingyu Zhou, Hu Chen, Delin Mo. Integrative Analysis of Porcine microRNAome during Skeletal Muscle Development. PLoS ONE 8(9): e72418. doi:10.1371/journal.pone.0072418 中山大学生命科学学院中山大学生命科学学院 找出miRNA在猪 骨骼肌发育的不同 阶段中所起的调控 作用。 转录组研究材料： 猪的骨骼肌的10个不 同发育阶段的样品； （交配后35,49,63,77, 91天，出生后2,28,90, 120,180天） 测序策略： 181M数据量 （Illumina Hiseq 2000） ） 1.得到了181224007条reads，其中 96%可以比对到miRNA数据库。 由此获得了猪骨骼肌miRNA组结 果： 247条(32.76%)已知miRNA, 210条(27.85%)已知miRNA前体 和297条(39.39%)候选新miRNA。 2.找出了表达量较高，可能参与 骨骼肌发育调控的miRNA及功能。 3.对骨骼肌发育各阶段 中差异表 达的miRNA的表达模式进行了分 析。 目的与意义实验设计 研究成果 各样品测序所得各样品测序所得reads的成分分析的成分分析 如图所示。 A图表示10个样 品的reads长度分 布。 B图表示10个样 品总reads的注释 结果在长度上的 分布。 C图：左图为10 各样品的总reads 的注释结果统计， 右图为唯一比对 的reads的注释结 果统计。 各样品各样品miRNA组的表达量及功能分析组的表达量及功能分析 Figure 2. Comparison of differentially expressed (DE) miRNA among three data sets. The number marked in the overlapping areas shows the common DE miRNAs. 差异表达的差异表达的miRNA在样品间的分布统计在样品间的分布统计 miRNA Target Genes的的KO分析分析 图A是全部样品的miRNA靶基因的KEGG显著性富集结 果，图B为三个阶段里的KEGG显著性富集结果。从图 中可以得到miRNA疑似调控的基因在骨骼肌生长的不 同阶段中主要参与了那些功能。 差异表达的差异表达的miRNA趋势分析趋势分析 使用STEM软件对 差异表达的miRNA 进行了趋势分析： A表示在骨骼肌纤 维组装过程 （35dpc77dpc） 共4个样品中差异 表达的miRNA聚类， 有3个趋势显著； B表示在骨骼肌纤 维成熟过程 （77dpc180dpn) 共6个样品中差