实验七植物多糖的制备及含量的测定

实验七 植物多糖的提取及含量的测定一 实验目的及要求1 了解植物多糖的化学性质及用途2 学习制备植物多糖的原理和方法3 学习和掌握苯酚-硫酸测定多糖的原理和方法二 原理 多糖是一类天然高分子化合物，是由上千个单糖以糖甙相连形成的高聚物，一般有1.4及1.6甙键两种。 按其功能分：结构多糖 构成植物的骨架的原料（不溶于水，如植物的纤维素和动物的甲壳多糖）；贮存多糖（淀粉和糖原）；功能多糖（如粘多糖）。大多数多糖在水溶液只能形成胶体，无甜味，一般不能形成结晶，无还原性。不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，具有吸湿性。所以大多数多糖的提取多数采用热水或稀碱浸提，乙醇沉淀多糖的方法来提取多糖。 多糖的测定采用苯酚-硫酸法，其原理多糖在硫酸作用下脱水生成糠醛及其衍生物，苯酚与其显色反应呈现棕黄色，己糖在490nm(戊糖和糠醛酸在480nm)有最大吸收峰，吸收值的大小与糖含量成线性关系，测定范围在10-100ug。该方法的特点是简单、快速、灵敏、 颜色稳定目前许多研究报道多糖具有许多生理功能，如香菇降低胆固醇、抑制转氨酶活性、抗辐射等作用。因此测定和提取植物多糖在医药方面具有重要的现实意义。三 试剂和器材1 6%的苯酚溶液2 标准葡萄糖溶液 精密称取105干燥恒重的葡萄糖100mg，溶解定容于100ml的容量瓶中，摇匀。用前稀释10倍，此溶液含葡萄糖0.1mg/ml。3 浓硫酸、正丁醇、氯仿、乙醚、乙醇四 操作方法1 粗多糖的提取材料处理（0.5g）热水提取离心分离上清液sevag法脱蛋白两次离心分离上清液加入3倍体积的95%乙醇 (过夜使多糖沉淀完全)用80%乙醇、95%、沉淀干燥粗多糖加入蒸馏水溶解定容到50ml。1) 称取黄芪根1 kg（0.5g），去掉杂质和泥土，粉碎成粉末2) 黄芪根粉末中加以6-7倍的蒸馏水 (或CaO溶液)，煮沸1.5 h（1h），用4层纱布过滤，CaO溶液提取法：CaO+H20=Ca（OH）2一摩尔氧化钙吸收一摩尔水生成一摩尔氢氧化钙。如用配制1000g该溶液，则其中含有1g氢氧化钙，这1g的氢氧化钙是由56/74g的氧化钙和18/74g水混合而成的，故只需要向烧杯中依次加入56/74g氧化钙和（999+18/74）g水搅拌均匀即可。 3) 滤渣用同样方法煮沸3次合并滤液，调pH值至6.5左右，加热浓缩至一定量4）.将浓缩液以 2000 r/min离心 10 min，上清液用Sevag 法法脱蛋白两次，Sevag 法是去除游离蛋白的有效方法。在粗多糖溶液中加入氯仿正丁醇混合溶液进行充分振摇,将游离蛋白变性成为不溶性物质,经离心分离去除,可达到去除的目的。取粗多糖溶液4 ml ,氯仿正丁醇(预先配制成体积比为41 混合液) 溶液1 ml ,置于具塞试管中,充分振摇30 min 后,经离心机离心1 min ,然后将水相与氯仿相分开。将水相再加入相当于其体积1/ 4 的氯仿正丁醇溶液,重复上述过程,共计重复三次。多糖溶液体积较大时也可以采用分液漏斗，人工进行剧烈振荡后直接分离，注意振荡强度与分离效率关系很大。操作过程中蛋白质多出现在两相界面处。5) 2000 r/min离心 10 min，上清液中加 3 倍量95 %乙醇沉淀倾去上清液(过夜使多糖沉淀完全)，沉淀物中再加入 95 %的乙醇至浓度为80 %，静置20min，6）.倾出上清，滤渣用丙酮洗涤 2次，过滤 将滤渣放入干燥器中，6）.- 20 冷冻真空干燥，即得到APS2 多糖含量的测定21 精密吸取葡萄糖标准溶液0.00、0.20、0.20、0.60、0.80、1.00 ml用蒸馏水补充至2.0ml，加入1 ml6%苯酚，摇匀，然后加入5ml浓H2SO4，另以1ml蒸馏水做同上操作，作为空白液,于室温下5min，80水浴中加热 15 min，取出，迅速冷却至室温，于490nm处测定吸光度值，以糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并计算归回方程。试管编号123456样品管葡萄糖标准（ml）0.000.200.400.600.801.00样液1.00蒸馏水（ml）2.001.801.601.401.201.001.006%苯酚（ml）1.001.001.001.001.001.001.00浓H2SO4（ml）5.005.005.005.005.005.005.00葡萄糖含量（g）020406080100490nmOD值2 多糖含量的测定将以上提取的粗多糖用热水溶解后定容于50ml容量瓶中，精密吸取1ml按标准曲线制作的方法操作，测490nm的吸光度值，从标准曲线计算多糖含量。C V总 D样品含糖量（%）= 100 W V测 106其中：C在标准曲线上查出的糖含量（g），V总提取液总体积（ml），V测测定时取用体积（ml），D稀释倍数