蛋白质之间的相互作用

.,蛋白质相互作用,20160222,.,酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始的认识，真核生物完整的转录因子是由：DNA结合结构域（DNA-Bindingdomain，BD）和转录激活结构域（transcription-activatingdomain，AD）构成的，它们是结构上可以分开的、功能上相互独立的结构域，BD识别DNA上的特异序列，并使AD定位于基因的上游，从而激活转录,单独的DNA结合域或转录激活域不能激活下游基因的转录，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能,它的基本原理是转录因子通过结合上游激活序列（UAS）启动下游报告基因的转录,酵母双杂交用于检测两种蛋白质之间的相互作用,.,通过因工程的方法，构建BD-X、AD-Y载体（X一般是已知的诱饵蛋白,Y可以是单一已知蛋白或者文库蛋白或者未知蛋白），在GAL4UAS和启动子的下游构建了3个报道基因Ade，His，LacZ），可以通过营养缺陷筛选、X-gal显色和酵母表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用,.,若X、Y相互作用，BD、AD间接连接，AD靠近转录起始位点激活下游报告基因的转录；反之X、Y之间没有相互作用，报告基因不表达,.,优点1.双杂交技术不需尖端设备，几乎在任何实验室都可以实现2.作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。3.检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。4.检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。,.,局限性1.双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工，而这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。2.酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录，即自激活。3.另外，某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生假阳性结果。4.外源蛋白对酵母菌的毒性作用,.,可替代方法：免疫共沉淀噬菌体表面展示GSTpull-downassay蛋白质芯片,.,免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）,是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的，用于研究蛋白质之间的相互作用，这种方法也常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质之间的相互作用被保留了下来。如果用一种蛋白质的抗体免疫沉淀该蛋白，那么与该蛋白在体内结合的另一种蛋白也能沉淀下来。,.,优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。,缺点为：（1）可能检测不到低亲和力的蛋白质蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有其它蛋白在中间起桥梁作用；,.,噬菌体表面展示(phagedisplaytechnology),将外源蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白表达在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内，使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。,噬菌体肽库与靶分子的相互作用洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体将特异性结合的噬菌体洗脱下来三轮淘选后，克隆测序,.,1.高通量的淘选将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬菌体展示肽库，利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来,2.易于纯化重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设备。用于鉴定表位和受体所用的噬菌体载体为M13噬菌体。由于M13噬菌体是温和型噬菌体，不裂解宿主菌，成熟的噬菌体可分泌到培养基中，通过离心收集培养上清，再向其中加入沉淀剂即可将上清中大量噬菌体粒子沉淀下来，从而富集得到含外源基因产物的重组噬菌体。,优点,.,（1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。（2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，蛋白质功能的实现是一个复杂的过程，部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解，因此，必须小心控制条件，以保证在噬菌体表面展示的文库没有降解。（3）噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。（4）由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。,局限性,.,其基本原理是将靶蛋白-GST（GST是谷胱甘肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。,GSTpull-downassay,.,蛋白质芯片,原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析,它具有以下优点：