中-南-大-学-生物学进展PPT课件

1,2007年，美国科学家马里奥卡佩奇和奥利弗史密西斯、英国科学家马丁埃文斯。这三位科学家是因为“在涉及胚胎干细胞和哺乳动物DNA重组方面的一系列突破性发现”而获得诺贝尔生理学或医学奖。,2,10月8日，日本京都大学物质-细胞统合系统据点iPS细胞研究中心长山中伸弥与英国剑桥大学发育生物学家约翰戈登，因在细胞核重新编程研究领域的杰出贡献，获得2012年诺贝尔生理学或医学奖。对此，业界的共识是:干细胞产业的发展前景逐渐明朗。“干细胞与医学研究”是现代生命科学发展的前沿。,3,2006年他们把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的诱导多功能干细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。在2007年11月，这项实验在人体皮肤细胞上也获得了成功。随后，众多科学家在小鼠、人等不同物种诱导多功能干细胞成功已经反复证明了细胞命运可以通过基因调节转换。,4,stemcell,DevelopmentalBiologySchoolofBiologicalScienceandtechnologyCentralSouthUniversity,zhangjianxiang,5,一、Whatarethestemcells?二、Classificationofstemcell三、Characteristicofstemcell四、Wheretogetstemcells？五、Whytostudy?Howtoseparateandgrow?andmore,6,一、Whatarestemcells?个体发育过程的发展和完成主要是通过细胞的分裂来实现的。细胞的分裂可以扩大细胞的群体，并由此伴随不同分化趋势的形成，所以，个体发育的过程实际上是细胞的不断增殖和有序分化的结果。在个体发育的不同时期，总有一些细胞保持分裂增殖能力、自我复制能力(自我更新)、和多向分化潜能。即能分化产生一种以上“专业”细胞的原始细胞称为干细胞（stemcell）。,7,在发育过程中，干细胞的“分化等级”不同。如存在于囊胚内细胞团（innercellmass，ICM）中的细胞具有分化为机体任何一种组织器官的潜能，习惯上把它称为胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES细胞）。这种干细胞的分化潜能很“宽”，认为它们是各种组织器官中的干细胞，具有自我更新能力。在成体内，通常只能分化为相应（或相邻）组织器官组成的“专业”细胞，称为成体干细胞（somaticstemcell）。其分化潜能较“窄”，这样的干细胞在个体发育中的“等级”较低。,8,二、Classificationofstemcell1.根据干细胞的分化潜能分为:.全能干细胞（Totipotent/Omnipotentstemcells）.多能干细胞（Pluripotentstemcells）（multipotentstemcells）.单能干细胞（Unipotentstemcells）2.根据干细胞的来源分为:.胚胎干细胞（Embryonicstemcells，ES细胞）.成体干细胞（Somatic/adultstemcells）.诱导干细胞（inducedpluripotentstemcelliPS),9,10,1.全能干细胞Totipotent/Omnipotentstemcells可以分化形成人体所有的各种细胞、或发育形成新的个体。是指在早期胚胎发育过程中的受精卵及受精卵分裂形成2个、4个或8个卵裂球时期的细胞。,11,卵裂期的全能干细胞Totipotent/Omnipotentstemcells,受精后3648h,受精卵,四细胞期,12,2.多能干细胞（Pluripotentstemcell）可以分化形成人体所具有的全部细胞、但不能发育形成新的个体。主要存在于早期胚胎发育形成的桑椹胚和胚泡的成胚体细胞。在此阶段只要提取一个细胞，都可以可以分化形成人体所具有的全部细胞，所以都是多能的干细胞。,胚泡期的多能干细胞Pluripotentstemcell,内细胞群,13,3.多能干细胞：multipotentstemcells各胚层期的多能干细胞multipotentstemcells,14,1.造血干细胞,2.造血祖细胞,很强的增殖潜能多向分化能力自我复制能力,增殖能力有限形成特定类型的血细胞,多能造血干细胞与单能造血祖细胞Multipotentstemcells、Unipotentstemcells,15,造血多能干细胞：MultipotentstemcellsUnipotentstemcells,16,4.单能干细胞：Unipotentstemcells单能的或者专能的，只能分化成一种细胞，或者是分化成关系比较密切的两种细胞，这叫单能干细胞。单能干细胞存在非常广泛，存在机体的组织器官，大部分组织器官都要存在。,17,18,三、干细胞生物学特性受精卵通过不同的增殖分化途径，形成不同特征的细胞组成功能各异的组织器官。即使在动物个体成熟之后，机体的组织仍然保持自体稳定性（homeostasis），即在特定组织中细胞的死亡和增生保持动态的平衡。此外，各种组织还保持着程度不同的损伤后再生的能力。如一些两栖类动物的肢体在损伤后可完美的再生；哺乳动物的造血系统，小肠，毛发，皮肤也保持了一定的再生能力；肝在损伤不太严重时也可部分再生。,19,(一)干细胞的形态和生化特征1.干细胞的形态特征：干细胞在形态上有一些共性。在体外呈圆形，卵圆形，核型正常，单层或多层，密集堆积而形成岛状或巢状群体生长状况;在体内细胞通常呈圆形或椭圆形，体积较小，核质比相对较大。不同种类的干细胞生化特征各有差异，都具有比较高的端粒酶活性，这与其增殖能力是密切相关的。如造血干细胞（hematopoiesisstemcell，HSC）有类似癌细胞的端粒酶活性，而由其分化产生的专能性祖细胞的端粒酶活性则显著下降。,20,2.生化特征：表现为端粒酶活性高，碱性磷酸(Alkalinephoshatase，AKP)和特异性免疫标志物：阶段特异性胚胎抗原（Stage-specificembryonicantigen，SSEA），TRA-1-60表达。具有全能性或多能性，在适当条件下ES细胞可被诱导分化为多种特定的细胞或组织，包括神经元、造血干细胞和心肌细胞;是研究哺乳动物胚胎早期发生、细胞分化、基因调控等发育生物学基本问题的理想模型。,胚胎干细胞的特征：,21,细胞标志物:ES细胞表达早期胚胎细胞及胚胎肿瘤细胞(Embryonalcarcinomacells，EC细胞)的表面抗原、AKP及端粒酶活性。但细胞标记物SSEA的表达的种属差异性：在鼠和人的ES细胞之间存在种属差异性，如小鼠内细胞群(Innercellmass，ICM)的ES细胞均表达SSEA-1，但不表达SSEA-3和SSEA-4；而人和恒河猴ES细胞SSEA-1为阴性，但分离的人ES细胞或原始生殖细胞(Primordialgermcells，PGCs)SSEA-l、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60等均为阳性，利用这种差异和表面标志物可以验证胚胎干细胞。,22,表几种不同细胞的标志物SSEA-1SSEA-3SSEA-4TRA-1-60TRA-1-81AKP端粒酶小鼠ICM？ES？EC？EG？人ESEC？PGCs/？恒河猴ES？+阳性，-阴性，+强阳性，-/+可疑阳性，？未见报道,23,ES的生物学特性小结,a.ES形态学特性与生长特性，在体外呈圆形，卵圆形，核型正常，单层或多层，密集堆积而形成岛状或巢状群体生长状况;在体内细胞通常呈圆形或椭圆形，体积较小，核质比相对较大。b.ES在体内能自我复制，体外培养细胞能增殖，选择克隆和冷冻保存等，冷冻不失其原有的特性。c.ES具高度分化的潜能，ES在外培养需要在饲养层上培养才能维持为分化的状态，一旦脱离饲养层就自发进行分化。d.人胚胎干细胞表面抗原及定向诱导分化。,24,(二)干细胞的增殖特征1、干细胞增殖的缓慢性当干细胞进入分化程序前，首先要经过一个短暂的增殖期，产生过渡型细胞(transitamplifyingcell)。经若干次分裂后产生分化细胞，过渡细胞的作用是可以通过较少的干细胞产生较多的分化细胞。认为缓慢增殖有利于干细胞对特定的外界信号作出反应，以决定进行增殖还是进入特定的分化程序；缓慢增殖还可以减少基因发生突变的危险；以便终生存在于机体内。由此，有学者认为干细胞的作用可能不仅仅在于补充组织细胞，干细胞的存在还具有防止体细胞自发突变的作用。,25,2、干细胞增殖系统的自稳定性自稳定性(self-maintenance)是指干细胞可以自我更新(selfrenewing)并维持其自身数目恒定。这是干细胞的基本特征之一。3、干细胞分裂特性当干细胞分裂时，如两个子代细胞都是干细胞或都是分化细胞，则称为对称分裂(symmetrydivision)；产生一个子代干细胞和一个子代分化细胞则称为不对称分裂(asymmetrydivision)。无脊椎，不对称分裂是干细胞维持自身数目恒定的方式。,26,(三)干细胞的分化特征1、干细胞的分化潜能受精卵分裂成多个完全一样的全能细胞，将这些细胞中的任何一个，放到女性的子宫内，都可发育为胚胎，这种细胞和受精卵统称为全能性(totipotent)干细胞。胚泡中的内细胞团细胞称为胚胎干细胞，可以分化为任何一种组织类型的细胞，具有多能性(pluripotent)，但不能分化为生物个体。多能性干细胞进一步分化产生成体干细胞，如肠干细胞(intestinalstemcells)可分化产生肠的吸收细胞(absorptivecell)、杯状细胞(gobletcell)、潘氏细胞(Panethscell)和肠内分泌细胞。这种干细胞被称为专能性干细胞(multipotentstemcells)，其分化潜能受到限制，能分化形成与之相关的特定功能的细胞。,27,2、干细胞的转分化和去分化成体干细胞被认为只能向一种类型或与之相关的细胞分化，如神经干细胞只能向神经系统细胞分化而不能分化成其他类型细胞。但目前证据表明，自成体分离的干细胞仍然具有相当的可塑性。一种组织类型的干细胞在适当条件下可以分化为另一种组织类型的细胞，称为干细胞的转分化(transdifferentiation)。1997年Eglitis等人证明成年动物的造血干细胞可分化成为脑的星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。造血干细胞还分化形成肌细胞、肝细胞；神经干细胞转化为造血细胞等。一种干细胞向其前体细胞的逆向转化被称为干细胞的去分化(dedifferentiation)。有实验表明，把成体鼠的造血干细胞注入鼠胚泡的内细胞团后，成体鼠造血干细胞的分化状态发生逆转，开始表达胎鼠的珠蛋白基因，并参与胚胎造血系统的发育。,28,(四)干细胞增殖与分化的微环境干细胞在机体组织中的居所称为干细胞巢(stemcellniche)。在干细胞巢中所有控制干细胞增殖与分化的外部信号构成了干细胞生存的微环境。包括以下三个层面:1、分泌因子:为数众多的分泌因子对干细胞的生存、增殖和分化具有重要的调控作用。如转化生长因子(TGF)和Wnt家族的分泌信号分子有重要作用。2、受体介导的细胞间相互作用:现已知由Notch受体及其配体Delta介导的细胞粘附与Numb蛋白的协同作用调控着果蝇感受器官干细胞的正确分化。3、整合素和细胞外基质:干细胞与细胞外基质(extra-cellularmatrix，ECM)的附着可以由多种受体介导，目前认识最多的是整合素。如-整合素对维持表皮干细胞(epidermalstemcell)的增殖分化至关重要。,29,干细胞的存在部位目前仍未确定，也没有与分化细胞截然不同的形态学特征。不同的干细胞具有各异的生化标志，这对于确定干细胞位置、寻找和分离干细胞有重要意义。如角蛋白15是确定毛囊中表皮干细胞的标志分子，巢素蛋白（nestin）为神经干细胞（neuralstemcell，NSC）的标志分子等等。因此不能仅根据细胞的形态和生化特征来寻找干细胞。具有增殖和自我更新能力以及在适当条件下表现出一定的分化潜能才是干细胞的本质特点。,四、Wheretogetsomaticstemcell?,30,四、Wheretogetsomaticstemcell?,HumanembryosthatareafewdaysoldFetaltissuefromterminatedpregnanciesBabyteethUmbilicalcordbloodandUmbilicalcordAdulttissues:brain,bonemarrow,skin,liver,skeletalmuscles,etc,31,胚胎干细胞（Embryonicstemcells),胚胎干细胞又可分为两种即异体胚胎干细胞、自体胚胎干细胞异体胚胎干细胞：是通过自然怀孕或人工受孕获得胚胎，然后再在胚胎不同发育阶段，提取能分化发育成各种器官组织的干细胞，以培养人们所需的器官组织为目的，只为获得干细胞。遗传基因可能全部或部分由供体提供。自体胚胎干细胞：是通过胚胎克隆的技术路线获取胚胎干细胞。所有遗传基因都可能来源于受体自身。,32,(一)人胚胎干细胞的获得胚胎干细胞通常是从囊胚期胚胎的内细胞团获得的。人和小鼠的原始生殖细胞(primordialgermcell，PGC)经适当信号分子的作用后，可从中获得胚胎干细胞。从59周龄流产胎儿的性腺嵴（gonadalridges）及肠系膜中分离获得多潜能干细胞系，利用体细胞核移植技术是获得胚胎干细胞从脐带血中获得干细胞。,33,(二)成体干细胞的获得adult/Somaticstemcells新近的研究表明，众多成体组织中（如骨髓、肌肉、胃肠道、皮肤、视网膜、外周及中枢神经系统等）均存在干细胞，称为成体干细胞。多数成体干细胞在出生前或出生后很短时间内分化为特定的组织细胞，仅一小部分仍然保留干细胞的特性存在于组织中。与胚胎干细胞相比，成体干细胞在移植医学中有诸多优势。,34,如：从患者身上直接分离干细胞，在体外进行大量增殖，诱导它们分化为所需细胞类别，再将它们移植回病人体内，这样不会因发生免疫排斥反应而失败，同时还可以避免使用来源于人体或胎儿的干细胞所带来伦理上的争端。另外，成体干细胞具有可塑性，能够分化为多种组织细胞成分，其中以造血干细胞和神经干细胞最引人注目。,35,36,Adultstemcellsoccurinmanytissues.Theyenternormaldifferentiationpathwaystoformthespecializedcelltypesofthetissueinbody.Adultstemcellsmayalsoexhibittheabilitytoformspecializedcelltypesofothertissues,whichisknownastransdifferentiationorplasticity.Hematopoieticstemcellsgiverisetoallthetypesofbloodcells:RBC,BL,TL,NKC,N,B,E,M,Pt,andmacrophages.Bonemarrowstromalcells(mesenchymalstemcells)giverisetoavarietyofcelltypes:bonecells(osteocytes),cartilagecells,fatcells(adipocytes),andotherkindsofconnectivetissuecellssuchasthoseintendons.,37,Neuralstemcellsinthebraingiverisetoitsthreemajorcelltypes:neuronsandtwocategoriesofnon-neuronalcellsastrocytesandoligodendrocytes.Epithelialstemcellsintheliningofthedigestivetractoccurindeepcryptsandgiverisetoseveralcelltypes:absorptivecells,gobletcells,Panethcells,andAPUD.Skinstemcellsoccurinthebasallayeroftheepidermisandatthebaseofhairfollicles.Theepidermalstemcellsgiverisetokeratinocytes,whichmigratetothesurfaceoftheskinandformaprotectivelayer.Thefollicularstemcellscangiverisetoboththehairfollicleandtotheepidermis.,38,Hematopoieticstemcellsmaydifferentiateinto:threemajortypesofbraincells(neurons,oligodendrocytes,andastrocytes);skeletalmusclecells;cardiacmusclecells;andlivercells.Bonemarrowstromalcellsmaydifferentiateinto:cardiacmusclecellsandskeletalmusclecells.Brainstemcellsmaydifferentiateinto:bloodcellsandskeletalmusclecells.,39,成体干细胞的特点a.一般处于休眠状态b.在不同的情况下表现出不同程度的增殖和自我更新，使机体的组织仍然保持自体稳定性（homeostasis）c.多数情况下，成体干细胞分化为与组织来源一致的细胞，但有些情况下，会展现出很强的跨系或跨胚层分化的潜能。,40,（三）StemcellofUmbilicalcordblood,41,图3人脐血MSCs表面CD分子测定ACD34BCD45CCD44DCD105,42,43,44,Whytousestemcell,?,45,胚胎干细胞的应用前景ES细胞系的建立对科学发展和人类健康具有极其重要的意义,具有其它干细胞系无法替代的作用：.研究基因功能的有效手段，根据同源重组的原理，利用基因打靶技术进行基因组内指定基因的失活，研究人体某一基因的功能。,Whytostudystemcells?,46,.揭示人及动物发育过程中的决定基因，有助于阐明发育早期的复杂事件。.可作为评价新药及化学产品毒性及效能的检测系统，能够极大地改进评价药品安全性的实验方法。例如，新的药物或治疗方法可在人的ES细胞系进行实验，既可缩短药品研制的时间，又可以更安全地进行动物和人体实验，这样可降低成本，缩短研究周期，具有重要的商业价值。,47,.组织、细胞移植和基因治疗的载体的重要来源，即ES细胞有可能成为细胞替代疗法和组织器官移植的最佳来源。ES细胞作为个体发育的原始干细胞，理论上，它可无限地提供特异性细胞类型，用于置换疾病组织和放化疗损伤后的造血系统，为遗传病、肿瘤和衰老等疾病的治疗提供新的途径。目前已经发现ES细胞可以分化为包括神经干细胞、胰岛样结构等三胚层的多种组织细胞成分，但是，这种干细胞也存在与患者缺乏遗传上的相容性，移植物因免疫排斥而失败，相信通过基因工程技术敲除干细胞MHC抗原，制成通用型干细胞有望克服宿主抗移植物反应。,48,Tissue/cellsfortranslationHeartdiseaseDiabetesParkinsonsdiseaseEnd-stagekidneydiseaseLiverfailureCancer,49,自体胚胎干细胞的研究和应用通过体细胞的核移植到卵细胞里，把卵细胞的核取出来，这叫无性生殖。现在很多都是治疗性克隆，通过提取干细胞，用于治疗供核者本身的疾病。自体胚胎干细胞的研究非常有意义，潜能非常大。现在医学对很多慢性、非传染性疾病无能为力；但是干细胞的研究，特别是自体胚胎干细胞，将来可以提取干细胞，用于治疗衰老及老年痴呆、糖尿病。癌症是癌细胞无限扩增，破坏正常组织；心肌梗塞是因为心肌细胞坏死了。干细胞的研究都可以治疗这些疾病，当然还有一个过程，现在已经得到了很好的运用，而且进展非常快。,50,采用培养人体自身干细胞的方法培育各种器官组织，就可用于器官组织移植，或直接在坏死的器官组织部位培养出新的器官组织。因此，用干细胞培育器官组织的概念，实际上是用干细胞重新发育分化成器官组织，即再造器官组织，这与克隆人（生物体）既有联系又有区别。或许称“再造器官组织”比称“克隆器官组织”更好，概念更明确亦不易混淆。,51,干细胞“生产”器官再造器官组织新概念一些生物诸如蝾螈、水蛭和章鱼等，如果手、足甚至半截身子断了，很快就能重新长出来。研究人员认为，这些生物全身都有像胚胎干细胞那样的能进行全能分化增殖的细胞，即干细胞。现代科学术已经能在体外鉴定、分离、纯化、扩增和培养人体胚胎干细胞和各种器官组织干细胞。,52,干细胞再造组织器官研究动物实验显现曙光美国先进细胞技术公司和哈佛医学院等研究人员称，2002年月的自然生物技术杂志以封面文章形式，发表他们联合研究的实验结果，证明用克隆羊多利的方法可以提取干细胞，并定向培养成各种器官组织，这种器官和组织不会引起受体免疫排异反应。这两个机构的研究人员从成年母牛耳朵上提取皮肤细胞（体细胞），将其植入另一只母牛的去核卵细胞中，再用电刺激法促使它们融合并发育分化。细胞分化天后形成胚囊，即胚胎干细胞团。此时，研究人员将它们植入代理母牛子宫，经过周孕育成早期胚胎。,53,研究人员从早期胚胎中分离提取心脏、骨骼和肾脏等干细胞，并将其放在三维“支架”上培养成相应器官组织；再把这些由胚胎干细胞形成的早期器官组织，植入提供皮肤细胞的母牛体内。个月之后，母牛免疫系统没有出现排异迹象。而且用这种克隆方法培育的器官组织，与普通牛器官组织功能类似。这说明利用克隆羊多利的技术路线，可以获得不受免疫系统排异的较为理想的器官。这种方式如果用在人身上，是否完全没有免疫原性，即刺激受者免疫系统并产生排异，还得靠实验证明，因为这种再造(克隆)器官的细胞中还含有他人的线粒体DNA，其编码产生的蛋白质有可能引起免疫排异。,54,小鼠模型中的心肌功能有可能成為未來的心肌梗塞治療方式最近在佛羅里達州奧蘭多市召開的第四十三屆美國血液學會年會上，有研究報導，向梗死的小鼠心組織中，注射骨髓幹細胞，可以使功能性心肌再生。來自美国國家衛生研究院、國家人類基因組研究所的DonaldOrlic博士說：“成人幹細胞可用於修復器官並且可用於治療心臟病，以及其他疾病的理論，看來已經更進一步成為事實。”,55,Orlic的研究小組在小鼠體內引起心梗，將骨髓幹細胞注射入鄰近梗塞心肌的健康心肌中。心肌梗塞27天後，70的实验组的心肌梗塞的小鼠，呈現再生的跡象，肌細胞開始生長，含有成熟紅細胞的血管形成，顯示這些血管與存活的冠狀動脈連通。基因標誌物顯示，心臟中的再生細胞，是由最初的骨髓細胞轉化而成。实验组小鼠，存活率為73，而未治療對照組的存活率為17，在第九天時，心臟射血分數，实验组比對照組高48，第16天時，实验组比對照組高62，第26天，实验组比對照組高114。,56,骨髓幹細胞也可以發揮肝臟的功能根據在Dallas的美國肝臟疾病研究聯合會年度會議的研究指出：部分人群的骨髓幹細胞可以表達肝臟專一的功能。LosAngelesCedars-Sinai醫學中心的Avital發言：“我們可以向失去肝臟功能的患者，移植來自其自身骨髓的幹細胞，不用擔心免疫排斥反應，就可以產生一個新的肝臟代替沒有功能的肝臟。這種治療還有希望在單基因病的治療中發揮作用，從患者體內提取的幹細胞，並把它植入肝臟中，患者可以緩解由於遺傳造成的缺陷。”,57,這項研究，首先分離、定型來自骨髓的肝母細胞(干细胞)，標記造血干細胞，并将造血干细胞和肝母細胞混合培养。研究中，Avital小組分離來自大鼠和患有爆發性肝壞死，酒精性肝炎，原發性肝導管硬化，和原發性膽汁淤積性肝硬化患者的幹細胞。去除原來的肝細胞後，經培養的大鼠和人類骨髓來源的肝幹細胞表現肝細胞專一的標記，並發揮肝臟特有的功能，包括清除氨和合成尿素的功能。在肝小叶内內，一部分細胞與肝細胞板結合併轉化為成熟的肝細胞。,58,經肝臟移植的大鼠沒有出現免疫排斥，並且，用幹細胞移植的大鼠的生存期，比沒有用幹細胞移植的大鼠延長了150。Avital說：“我們現