手性药物的酶促合成

Enzymatic Synthesis and Enzymatic resolution of Chiral Drugs,第四章,手性药物的酶促合成与酶促拆分,2006.3,本章内容,1 手性药物概述2 手性药物的生物催化合成3 手性药物的酶促拆分4 本章总结,1 手性药物概述,手性：英文名chirality，源为希腊文cheir，手或handedness，是用来表达化合物分子结构不对称的术语。人的手是不对称的，左手和右手相互不能叠和，彼此是实物和镜像的关系。这种关系在化学中称为“对映关系”。具有对映关系的两个物体互为“对映体”。,1.1 手性与手性药物,2001年10月10日瑞典皇家科学院在斯德哥尔摩宣布：,一半授予美国科学家William S.Knowles和日本科学家野依良治,另一半授予美国科学家K.Barry Sharpless,2001年诺贝尔奖,三位获奖科学家的贡献就在于他们找到了立体选择性合成的方法和催化剂，可以高效快速地合成一种手性分子而不生成另一种，这为开发具有新特性的分子和物质开创了一个全新的领域。目前人们已根据他们的研究成果研制出了抗生素、消炎药和心脏病药等许多药物。,手性药物：,药物的药理作用是通过与体内的大分子之间严格的手性识别和匹配而实现的. 虽然对映异构体药物的理化性质基本相同，但由于药物分子所作用的受体或靶位是由氨基酸、核苷、膜等组成的手性蛋白质和核酸大分子等，后者对与之结合的药物分子的空间立体构型有一定的要求。因此，对映异构体在动物体内往往呈现出药效学和药动学方面的差异。鉴于此，美国食品药品监督管理局规定，今后研制具有不对称中心的药物，必须给出手性拆分结果，欧盟也提出了相应的要求。,震动了医学界，当时以消旋体用作缓解妊娠反应药物，但后来在欧洲发现曾服用此药的孕妇产下四肢呈海豚状的畸形儿。近期研究表明，两个对映体都有镇静作用，原因出自代谢转化产物。S(-)沙利度胺的二酰亚胺进行酶水解，生成邻苯二甲酰谷胺酸，后者可渗入胎盘，干扰胎儿的发育造成畸胎，而R(+)异构不产生相同的代谢产物，因而不致畸。,沙利度胺(Thalidomide,反应停)事件,1.2 手性药物对映体药效学差异,只有一种对映体具有所要求的药理活性,而另一种对映体没有药理活性 一种对映体中的两个化合物有等同的或接近等同的药理活性 两种对映体具有不同的药理活性 各对映体药理活性相同但不相等,Examples,布洛芬(Ibuprofen)的活性成分是S(+)布洛芬，R(-)异构体无效。S(+)布洛芬对慢性炎症和风湿病的疗效与消旋体相当。但剂量仅为消旋体的一半。 萘普生(Naproxen)是一种常用的抗炎和解热镇痛药。目前主要以S(+)异构体上市，其S(+)异构体的抗炎和解热镇痛活性约为R(一)异构体的1O一2O倍 。 左旋氧氟沙星(Levofloxacin)是广谱抗菌药，其作用是外消旋体的二倍，是右旋体的8-12倍。而右旋体无效，且未发现有任何副作用。 环磷酰胺(Cyclophosphamide)是一种常见的抗肿瘤药，目前仍以外消旋体上市，其左旋体和右旋体均有抗肿瘤作用，但左旋体的抗肿瘤作用是右旋体的两倍。 1R，2R(-)氯霉素(Chioramphenico1)有抗菌活性，其他异构体则无效。,手性药物两种对映体的不同药理作用,具有互补作用,奈必洛尔是一种降压药，它的右旋体为B-受体阻滞剂，而左旋体能降低外周血管阻力。并对心脏有保护作用，因此以外消旋体给药为佳。 盐酸曲马多(Tramado1)的左旋体和右旋体的镇痛作用的机理分别是激动吗啡受体和抑制单胺递质再摄取，有协同作用，应用其消旋体使其镇痛作用增强。,1.3 相关术语及分析方法,对映体组成测定方法,Daicell 公司 Chiracel 柱Chiralcel ODChiralpak AD,比旋光度，核磁共振，气相色谱，液相色谱等,1.4 总结,手性药物光学异构体间表现出的药动学和药效差异显著，所以，研究一个手性药物时。仅对其外消旋体或某一个光学异构体进行生物学评价是不够的。必须对其所有的对映体分别进行生物学评价。在此基础上再确定是以外消旋体还是以其某一个光学异构体作为所要上市的新药。 美国FDA 于1992年3月公布了一系列准则。以指导这类药物的开发。要求对含有手性中心的药物，分别作每个旋光异构体的毒理和药理临床实验及其活性强度、质量和纯度的测定。证明它们都无任何有害作用，甚至对已上市的外消旋体药物也要按如此要求补做研究工作，完善其研究资料。 因而近年来手性药物的研究开发倍受关注。单一对映体药物不断上市。已有许多手性药物经“手性转换”以单一对映体代替了过去的消旋体。,2 手性药物的生物催化合成,尤其是利用水解酶类如脂肪酶、酯酶、蛋白酶拆分制备手性化合物，利用微生物中酶的多样性和立体选择性，可以合成一些化学方法难以实现的手性中间体。 例如麻黄碱(Ephedrine)可用发酵法制取，由苯甲醛和蔗糖在啤酒酵母存在下缩合，生成左旋体中间体，再与甲胺缩合，催化氢化后得(1R，2S)一(一)麻黄碱。,2.1 概述,高度立体选择性，底物专一性副反应少，反应条件温和，可避免消旋，重排，异构化的产生工艺和产品绿色,Enantioselectivity,立体选择性生物催化,手性识别的原因：接受体或酶的活性位点对不同对映体，匹配度不一样。,水和有机溶剂组成的各种反应系统,反应介质,2.2 非水介质中的生物催化反应,反相胶束体系,超临界流体体系,离子液体体系,反应介质的影响有机溶剂通过影响底物、产物在水相和有机相中的分配， 从而影响它们在酶必需水层中的浓度来改变酶催化反应速度有机溶剂直接与 酶必需水作用，强极性有机溶剂可溶解大量水，有夺走必需水的趋势，导致酶失活有机溶剂对酶的直接影响 有机溶剂使底物基态能级下降或使酶底复合物能级升高 有机溶剂分子进入酶活性中心，降低中心内部极性并加强底物与酶 之间形成的氢键 有机溶剂侵入会造成酶的三级结构变化，间接改变酶活性中心结构,有机溶剂的极性,溶剂的极性对酶的催化活力也有较大的影响。一般认为酶在非极性溶剂中的活力较高。logP越大，疏水性越强，酶的活力越大。,但是过于增大溶剂的疏水性，酶的活力反而降低。这可能是因为溶剂的疏水性太强，疏水性的底物不容易从溶剂中扩散到酶分子的周围，导致酶的活力降低。,同时也有资料表明，若溶剂的分子结构和底物的结构相似时，溶剂会作为酶活性中心的抑制剂而降低酶的活力。,值得说明的是溶剂在提高选择性的同时并不一定会使反应速率增加，也可能使反应速率变慢。一个非常慢的反应即使有很高的选择性，也难有实际用途，而一个快速反应即使对映体选择性稍差，也有可能得到高光学纯度的产物。所以在选择拆分介质时，对酶的催化活力，对映体选择性和反应速率三者要兼顾。,PSL脂肪酶催化潜手性二氢吡啶二羧基酯类衍生物的选择性水解,在不同的有机溶剂中，酶具有不同的立体选择性，相同的酶在不同的有机体系反应所得产物的构型相反。,有机溶剂中酶的催化作用，水仍然是必需的基本条件。酶蛋白分子周围紧密结合着一层水，成为必需水。在绝对无水的体系中，酶不表现催化活性。 酶在有机相中必需水的含量有一个最佳值，当有机溶剂中必需水的含量超过最佳含水量时，酶容易形成聚集体而变得不稳定，且催化活力降低。酶在不同的有机溶剂中保持一定的活力所需必需水的含量并不相同。 同时，必需水的含量与溶剂的极性有直接的关系。极性溶剂易与酶争夺必需水，但当增加水的含量时，酶也可以在极性较大的溶剂中保持一定的活力。,有机相含水量,CRL催化2溴丙酸的酯化反应,酶催化的还原反应能使分子内的酮基和碳碳双键立体选择性地还原产生特定构型的化合物，而常规化学法还原酮和烯烃则产生消旋体，因此酶催化的还原反应在手性药物合成中有重要的应用。,2.3 手性药物的生物催化合成,还原反应,钙拮抗剂类抗心绞痛药，橙色诺卡菌（Nocardia salmonicolor）可以立体选择还原酮。,SQ31765,a. SQ31765,b. 肉碱(L-Carnitine),肉碱(L-Carnitine) 6已在工业中得到应用(图2)。L-肉碱又称维生素BT，其异构体对人体有营养保健，减肥健美的作用，而D-肉碱无生理活性且对L-肉碱有拮抗作用。利用酵母菌BakersYeast催化不对称还原得到目标产物。,c. BMS-210 620,BMS-210 620(3)的合成中间体R)-醇(2)可由Spiwmonas paucirrtobilis SC16113菌株催化还原1制得。反应釜中加人树脂使产物的回收过程简单有效。,3-吡啶乙醇胺,3-吡啶乙醇胺(6)也是一种肾上腺能受体激动剂，一条实用的合成路线就是利用酵母菌Candida sorbophila催化不对称还原4得到关键的手性3-吡啶乙醇胺中间体5，达到75%的产率和99.5%以上的ee值。当用啤酒醉母还原时只得到了70%-80%的ee值。,(R)-地诺帕明(Denopamine, 9)是首例具有口服活性和长效治疗心脏病的药物，利用一株高还原活力的白地霉菌株Geotrichum sp. G. 38还原-羰基羧酸酯(7)，得到相应光学纯的羟基酸(8)成功合成了（9）。,(R)-地诺帕明(Denopamine),索他洛尔(Sotalol),索他洛尔(Sotalol)因为含有酸性的甲磺酰胺部分，是一种独特的抗心率失常新药。其d-型异构体是一种纯的类抗心率失常药物。利用白地霉菌株Geotrichum sp. G.催化还原-氯代酮(10)得到光学活性的相应氯代醇产物(11)成功制备了d-索他洛尔(12)(Scheme 3)。,托莫西汀 (Tomoxetine),托莫西汀 (Tomoxetine,17)是首例去甲肾上腺素再摄取抑制剂，是一种抗抑郁药，其(R)-(+)-异构体药效比其对映体高9倍。氟西汀(Fluoxetine,18)也是一种强效的抗抑郁药，而且其对许多病症，如焦虑、酒精中毒、慢性痛、肥胖、善饥以及厌食等均有很好疗效。利用啤酒酵母催化不对称还原苯甲酸乙酸乙酯(13)或3-氯苯丙酮(15)得到相应的手性醇再经化学转化径基的构型翻转分别制得两种对映体产物。利用固定化的白地霉菌株Ceotrichum sp.G.38催化还原13得到(S)-14合成了(R)-氟西汀(18)。,Omapatrilat (1)是一种抗高血压药物酶法/微生物法合成单一对映体是合成Omapatrilat的关键。利用谷氨酸酯脱氢酶还原胺化2-酮-6-羟基己酸得到6-羟基正亮氨酸。,Omapatrilat,索他洛尔,氧化反应,生物催化的氧化反应可以使分子内非活泼的碳氢键立体选择性氧化，产生特定构性的羟基化合物，这种碳氢键非活泼氢用化学法很难氧化。甾体激素的微生物转化是生物催化法在手性合成研究中应用最早和最成功的例子，从而推动了生物催化的手性合成研究与发展。生物催化的氧化反应较多的应用在手性环氧化合物的合成当中。手性环氧化合物是非常重要的手性中间体，有广泛的药用价值。Shell和Gist-Brocades公司利用微生物的-羟基酶对丙烯醚进行了不对称环氧化，生成了具有很大光学活性的(S)-环氧化物。这些方法同样在合成-受体阻滞剂(S)-美托洛尔(Metropolo1)和(S)-阿替洛尔(Atenolo1)工业得到了应用。此外，可用于环氧化的微生物还有血红素单氧化酶；甲烷单氧化酶和卤素过氧化物酶。,利用微生物生物转化制备甾体类药物已有多年的历史。常规化学方法很难氧化非活泼碳氢键，但是生物催化法却能奏效。例如蓝色梨头酶（Absidia coerulea）AS3.65 能使17-羟基-11-脱氢皮质酮（31）甾体环氧化产生氢化可的松（hydrocotison，32）。,甾体类激素,黑根霉（Rhizopus niger）能使孕酮（gestone，33）甾环环氧化产生11-羟基孕酮（34）。,另外也可用微生物降解甾体的侧链，例如谷甾醇（sitosterol，35）是植物油产生中的副产物，它被偶发分支杆菌（Mycobacterium fortuitum）的突变体氧化降解可出去侧链生成雄甾二酮（androstenedione，36），后者是一种有价值的甾体类化合物合成的起始原料。,卡托普利,卡托普利（captopril，38），又名巯甲丙脯酸。分子中含有两个手性中心，活性取决于含巯基烷链的构型，药物分子其（S,S）-对映体是（R,S）-构性药物活性的100倍以上。,也可以采用假单胞菌脂肪酶或黑曲霉脂肪酶水解拆分-甲基-乙酰硫代丙酸得到（S）-对映体，再经酰氯化及与L-脯氨酸缩和可得到。,水解反应和酯化反应,青霉素和头孢菌素,青霉素G，青霉素V和头孢菌素C可以由发酵法生物合成，将他们的侧链水解可以制备6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic acid， 6-APA）、7-氨基头孢烷酸（7-amino-cephalosporanic acid，7-ADCA），他们是半合成青霉素和半合成头孢菌素衍生物的母核，是重要的制药工业原料。D-苯甘氨酸和D-4-羟基苯甘氨酸是四种广泛使用的抗生素的侧链。通过酶法拆分消旋体海因类衍生物（53）可以得到D-4-羟基苯甘氨酸（54）。,奥硝唑和赛克硝唑,奥硝唑（ornidazole，57）和赛克硝唑（secnidazole，58）是广泛用于治疗厌氧菌、滴虫等感染的新一代5-硝基米唑类抗菌素。它们分子中有一个和不对称碳相连的仲醇，用酶催化拆分是比较快捷的方法。,3.手性药物的酶促拆分,定义：生物催化手性拆分是以酶或生物选择性催化外消旋底物中的某个对映体优先反应，再利用其与未反应对映体的物理性能差异达到拆分目的。原理：1）酶实际上是一个手性分子，和外消旋化合物中的两个对映体以不同的速度进行反应，从而达到动力学拆分的目的。2）如果两个对映体以相同的速度反应，但酶对一个反应中心所产生的构型是相同的，结果产生两个非对映体而被拆分。3）若一个底物为前手性的，它发生不对称反应而生成光学活性化合物。,AcylationHydrolysis,环氧化物水解,3.1 手性药物的酶促拆分,不对称水解反应,药物中间体,A. niger strains (SC 16310, SC 16311),Rhodotorula glutinis SC 16293,45的产率，e.e.值95，E值在25左右,甲基叔丁基醚 (MTBE),产率45，e.e.值达到99.9,腈水解,腈水解酶无须辅酶，催化氰基直接水解成羧基，而腈水合酶具有紧密结合的金属离子(Co或Fe)作为辅酶，首先催化氰基生成相应的酰胺，再经过酰胺酶或蛋白酶催化水解为羧基。,(R)-a-氟苯乙酸,(R)-异构体的氰基水解为羧酸，(S)-异构体不发生反应,通常是将要拆分的外消旋的底物进行酯化，然后再用脂肪酶立体选择性水解，从而获取其中一个对映体而另外一个不反应的对映体仍以酯的形式存在。,酯水解,ee%=99%,S-酮洛芬,Koul等人用Trichosporon sp. (TSL)，一种在当地乡村发酵干酪分离出的菌种通过不对称水解反应得到光化学纯度的萘普生，大批量生产已经达到千克级水平。,酰化反应,LiapseMY(triacylglycerol ester hydrolases, EC 3.1.1.3) from Candida rugosa (30 unites/mg of solid)通过不对称酯交换反应得到光化学纯度的萘普生酯，然后进一步水解即可得到目标产物,利用脂肪酶催化的选择性酯化反应，还可以直接用酸而不用酯。例如，外消旋酮洛芬的拆分。在含水0.1-0.5%（v/v）的四氯甲烷中用脂肪酶Candida antarctica Lipase催化酮洛芬R异构体与乙醇发生酯交换反应可以将外消旋酮洛芬加以分离。产物酯的对映体过剩值超过95%，其异构体酸可以游离状态回收。,呋喃型木酚醇(6)有保肝抗菌以及促进伤口愈合的功能，(2S，3R )-(6)的疗效远大于(2R，3S)-(6)。脂肪酶区域选择性催化其中一个羟基酯化并同时在另一个羟基上表达出立体选择性(见下图)。,影响酶促拆分的几个因素,酶源的影响 溶剂的影响 温度的影响 底物结构的影响 反应时间的影响,old,new,固定化酶的纯化酶的改性酶的修饰,新的菌种微生物,Enzyme activity（aw，pHenzyme form，solvent）,3.2 提高立体选择性的方法,酶,商品酶或粗酶中的杂酶或添加剂会降低酶的对映体选择性，因此纯化酶可以提高起其选择性。酶的修饰也是提高反应专一性和产率行之有效的方法。,酶的预处理,由于生物转化反应所用的酶几乎都来源于微生物，如何筛选出含有所需酶的微生物显得尤为重要。筛选中要注意以下3个要点：设计酶催化反应过程以确定所需酶的种类；确定将作选择性培养的微生物类别；确定便捷灵敏的检测方法以便选择所培养的微生物。随着科技的发展，新酶层出不穷。英国的Snell等从当地筛选出一种能降解乙腈的细菌Rhodococcus AJ270，其含有的一种腈水合酶具有单一的酰胺酶活力，能用于腈与酰胺的转化反应。David用该酶对消旋布洛芬酰胺进行动力学拆分，由于其对S布洛芬酰胺的选择性，水解速度快，经过适当反应时间后，可得到ee值为90%94%的S布洛芬。但若反应时间多短，则转化率不完全，底物利用率低；若反应时间过长，则底物完全水解，得到的将是产物的消旋混合体。,发展新酶,反应介质,溶剂工程(solvent engineering) ：通过改变溶剂可以调节酶的活性和选择性，改变酶的动力学特性和稳定性等酶学性质该技术不必改变蛋白质本身，只要改变反应介质就可以改变酶的催化特性，它在生物催化剂的开发与利用中将起着重要作用。溶剂的选择需注意：溶剂对底物和产物的溶解性要好，能促进底物和产物的扩散，防止由于产物在酶分子周围的积累，而影响酶的催化反应；溶剂对反应必须是惰性的，不参与酶的催化反应；溶剂的毒性、成本以及产物从溶剂中分离、纯化等问题。,多相反应体系离子液体,多相反应体系水有机溶剂两相体系（biphasic aqueous-organic solution）是指由水相和非极性有机溶剂组成的分相反应体系，酶溶解于水相，底物和/或产物溶解于有机相中。由于反应中及时将产物从酶表面移去，使反应朝产物生成方向进行，在水相反应中，由于水到存在会引起水解等逆反应的发生，使正反应产率降低。同时，有机助溶剂的加入降低了反应体系的水量或称其为水活度，从而抑制了逆反应的发生，使这种体系得到广泛应用。,Ju Nam Jin在研究酮洛芬酯水解反应中，采用了无溶剂双相体系，由单一