荧光标记型工具药在分子生物学中的应用.ppt

荧光标记型工具药在分子生物学中的应用（三）,六、同位素标记,同位素用于追踪物质与运行和变化过程时，叫做示踪元素。用示踪元素标记的探针，其生物活性和功能等保持不变。人们可利用这种探针，对有关的生物活性或过程等进行追踪，这种研究方法叫做同位素标记法。同位素可分为稳定同位素和放射性同位素两种。放射性同位素可利用其衰变时放出的放射线进行测量,6.1放射性同位素的一些基本概念和检测技术,放射性活度及其度量单位放射性同位素(radiosotlope)的原子核很不稳定，会不间断地、自发地放射出射线，直至变成另一种稳定性同位素，这就是所谓的核衰变。放射性同位素在衰变过程中原子数目的减少服从指数规律。随着时间的增加，放射性原子的数目按几何级数减少。放射性同位素不断地衰变，它在单位时间内发生衰变的原子数目叫做放射性活度，放射性活度的常用单位是居里（Curie），表示在1s内发生3.71010次核衰变，符号为Ci。,放射性同位素的半衰期放射性同位素在进行核衰变的时候，可放出射线、射线、射线和电子等。核衰变的速度不受温度、压力、电磁场等外界条件的影响，也不受元素所处状态的影响，只和时间有关。放射性同位素衰变的快慢，通常用半衰期来表示。半衰期即一定数量放射性同位素原子数目减少到其初始值一半时所需要的时间，用t1/2表示。半衰期很长的放射性同位素，在使用期间放射性变化不明显，如14C与3H。3H的半衰期为12.43年，如果标记物不受化合物分解的影响，储存5年，其放射性将保留原有的75%，而5年已远超过一般实验的日程。,放射性的测量放射性同位素发出的射线与物质相互作用，会直接或间接地产生电离和激发等效应，利用这些效应，可以探测放射性元素的存在、放射性同位素的性质和强度。用来标记各种射线的数目、测量射线强度、分析射线能量的仪器统称为探测器。探测器有多种类型，在生物学领域广泛应用是闪烁计数器，如闪烁探测器、液体闪烁计数器、晶体闪烁计数器。,6.2放射性同位素标记的氨基酸探针和蛋白质探针,常用14C、3H和35S来标记氨基酸探针，而蛋白质探针的标记常用125I。125I有较多的优点：一是半衰期适中，标记化合物可商品化，并可储存一段时间；二是它只发射28keV能量的X射线和35keV能量的射线，而无粒子，因而辐射自分解少，标记的化合物有足够的稳定性。放射性碘适用于标记蛋白质、肽类、固醇类、核酸类以及环型核苷酸衍生物等，且操作简单，一般实验室都不难做到。,氨基酸的放射性同位素标记氚气曝射法是用氚标记氨基酸等有机化合物的经典方法。其原理是借助于氚衰变的能量诱导1H-3H同位素交换反应。同位素标记的氨基酸与普通氨基酸相比具有结构一致、基本性质相同等的特点。作为示踪剂，氨基酸参与蛋白质的合成与代谢，为研究生物体中天然产物的合成、蛋白质的代谢以及疾病的诊断与治疗等提供了一个安全、有效，方便的示踪工具。,蛋白质和多肽类的放射性同位素标记常用的标记方法是氯胺T法。这种方法标记效率高、重复性好、试剂便宜易得。氯胺T是一种温和的氧化剂，在水溶液中产生次氯酸，可使125I-氧化成125I2。125I2可取代肽链上酪氨酸苯环上羟基邻位的一个或两个氢，使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链。,用标记转移技术研究蛋白质-蛋白质相互作用标记转移（labeltransfer）技术原理及步骤如图。选择一种交叉连接试剂，该试剂分子的一头为放射性同位素（常用125I）标记的基团，其中含有光反应活性的叠氮基团，另一头为亲电基团，中间为一段可还原断裂的连接臂（如二硫醚基团）；交叉连接试剂首先通过末端的亲电基团反应连接到某一种蛋白质上，所得修饰后的蛋白质重组为天然的复合体（即与第二种蛋白质结合）；基团P*中的叠氮被紫外光活化后与空间上最近的蛋白质（第二种蛋白质）分子发生交叉偶联反应（通过自由基机理）；最后，如果连接臂能够被还原断裂，发生标记转移（即P*基团由第一种蛋白质转移至第二种蛋白质），即表示两种蛋白质之间相互作用。用125I标记的125I-AET、125I-APDP、125I-SHAD和125I-SASD是转移标记中所用的几种交叉连接试剂。,放射性同位素标记的DNA探针和RNA探针20世纪70年代发展了两种在体外对核酸进行放射性标记的方法：T4噬菌体多核苷酸激酶催化的磷酸化法，此方法将ATP的-磷酸转移到DNA或RNA的5-羟基端；切口平移法，此方法利用大肠杆菌DNA聚合酶I将双链DNA上未标记的核苷酸置换成-32P标记的核苷酸。这两种方法成为以后分子克隆的主要方法。用这两种方法制备的放射性探针也有一定的局限性。放射性同位素标记的寡核苷酸探针,6.3放射性同位素标记的核酸探针,放射性同位素标记的核酸探针在分子克隆技术等分子生物学领域曾发挥了重要作用。常用的放射性同位素有32P、3H和35S等。,放射性同位素标记的底物在酶结构研究中的应用放射性同位素标记的底物在酶活性检测中的应用放射性同位素标记的小分子探针在生物学和医学领域中的应用受体的放射配体结合分析法（radio-ligandbindingassay，RBA）是一种在分子技术水平上研究配体（或药物）-受体作用机理和药效学评价的传统方法。其原理是：放射性同位素标记的配体（包括可与受体结合的药物、神经递质和激素等）与相应受体进行特异性结合，形成的复合物经分离后测定其放射性活度，分析受体的结合位点数和性质，配体与受体的结合一般是按照1:1的比例进行，并且是可逆的，据此可测定配体与受体的结合解离常数（KD）和亲和常数（KA）。常用于标记配体的放射性同位素为3H和125I。,6.4放射性同位素标记的小分子探针,放射性同位素标记的配体和药物在正电子发射断层现象技术的应用现代生物医学的研究重点已从静态转向动态，从形态转向功能，从宏观转向微观乃至分子水平。正电子发射断层显像（positronemissiontomography，PET）是目前唯一用解剖形态学方式进行功能、代谢和受体显像并提供分子水平信息的医学显像技术，在临床诊断和药物研究等领域有重要应用。PET是利用回旋加速器加速带电粒子轰击靶核，产生带正电子的放射性核素。利用正电子核素（它们多是人体组成的基本元素）及其标记的具有携带生物信息的人体生物活性物质（如糖、氨基酸、脂肪、核酸、配基或药物）等作为示踪剂引入机体。,PET技术具有许多优点：发射正电子的核素C、N、O和F（F的生理行为类似于H）大多都是人体组成的重要基本元素，应用正电子核素标记生物活性物质作示踪剂检查合乎生理要求，不干扰人体组织代谢与内环境的平衡；根据所用示踪剂的不同，PET能够反映组织细胞的葡萄糖及氨基酸及核酸代谢、血流分布、受体分布及DNA合成动力学，同时基因研究、新药开发、活体大脑感觉及认知等了解生命活动的物质基础、探识疾病病因及本质的有力工具；采用电子准直及符合探测技术，代替了铅栅准直，大大提高了探测效率，增加了图像的信息量，提高了空间分辨率（一般临床型PET的空间分辨率在45mm）；一次成像可快速获得多层面的断层图像，从而可一目了然地了解机体生理或疾病的全身状况，尤其有利于肿瘤转移或复发的诊断；可进行组织衰减校正、散射校正和时间衰变校正，从而可获得某一正常组织或病灶的多种功能参数，并对病变或正常组织、器官进行定量测定；所用示踪剂的正电子核素为超短半衰期核素，人体检查所受的辐射剂量较低。,代谢标记方法代谢标记方法是指利用培养细胞的代谢作用，将标记了核素的蛋白质参入细胞内的方法。通常将一定量细胞种类相同、蛋白质表达水平不同的两个细胞样品，分别置于正常培养介质和和富含某种重质同位素的相同培养介质中进行标记。反转标记方法反转标记方法需要进行两组实验：第一组为原标记实验；第二组以第一组为基础，将标记试剂反转使用。原来用轻质同位素试剂标记的样品改用重质同位素试剂，而原来标记重质同位素试剂的样品改用轻质同位素试剂，然后分别混合，采用质谱进行鉴定。这种方法的优点是大大增加了对样本中差异蛋白质识别的确定性，加快了分析速度，且该方法对体系复杂程度的耐受性也大大增加。,6.5稳定性同位素标记在蛋白质组学定量分析中的应用,提取后标记方法提取后标记方法是指先将细胞或组织破碎，提取出相关待分析成分后，再用同位素进行标记。该方法通常用于标记来源不同、细胞状态相同的肽段，待充分反应后，将两者混合，消化酶解成若干个肽段，然后用高效液相色谱分离，之后用质谱进行鉴定，通过识别并比较质谱图中前后相邻分布峰的强度来进行定量分析。,七、自旋标记,自旋标记（spinlabeling，SL）是将一顺磁性报告基因或分子加到被研究的体系中，借助报告基团的电子顺磁共振（electronparamagneticresonance，EPR）波谱特征来反映周围环境的物理、化学性质。,7.1基本原理,很多物质的分子不表现EPR，但对这些分子，人工地使之与顺磁性或自由基型的报告基团结合，从而得到用EPR技术来研究，获得独特的EPR信息。因自由基有不成对电子自旋，故称其为自旋标记。报告基团应具备如下条件：要足够稳定；能够以某种方式结合到被研究物质的某个位置上；报告基团的EPR波谱对环境的物