第12章++植物遗传转化.ppt

第十二章植物遗传转化,1、植物基因工程载体及其构建2、植物遗传转化方法和技术3、转化体的筛选与检测,植物遗传转化(plantgenetictransformation)是指通过某种途径将外源基因导入受体植物基因组中，并使之在受体植物细胞内实现功能表达。这个被导入的外源基因称为转基因(transgene)，所得到的植株称为转基因植物(transgenicplant)。植物遗传转化是植物基因工程的主要内容。通过基因转移技术可以把不同来源的基因包括来自异种植物、动物和微生物的基因导入植物细胞，这种大范围的基因交流为创造有价值的植物新种质材料，并培育新品种奠定了基础。,第一节植物基因工程载体及其构建,植物遗传转化的核心问题是将外源基因导入细胞，并使它得到表达。一般情况下，一个外源DNA片段是很难进入受体细胞的，或即使进入细胞，也很难进行复制和功能表达。因此，常常需要利用特定的运载工具，把外源DNA片段送入受体细胞，我们把携带外源基因进入受体细胞的这种运载工具叫做载体（vector）。载体的本质是DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连和导入受体细胞，还能利用本身的调控系统使外源基因在新的细胞中得到复制或表达。,一、植物基因工程载体种类,来源不同可分成有4类：细菌质粒（plasmid）：大肠杆菌质粒，农杆菌质粒噬菌体类：包括噬菌体衍生物、M13噬菌体、柯斯质粒酵母的质粒：病毒DNA的衍生物等。,按功能及构建过程，又可把有关载体分为四大类型,植物基因工程载体,中间克隆载体,克隆载体,中间载体,卸甲载体,转化载体,中间表达载体,onc-Onc+,一元转化载体（共整合载体和拼接末端载体）双元转化载体,克隆载体：用于保存和克隆目的基因。中间载体：包括中间克隆载体和中间表达载体，前者是由大肠杆菌质粒插入了T-DNA片段及目的基因、标记基因等构建而成，是构建中间表达载体的基础质粒。后者是含有植物特异启动子的中间载体，其功能是作为构建转化载体的质粒。卸甲载体：卸甲载体是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，其功能是作为构建转化载体的受体质粒。转化载体：是用于目的基因导入细胞的载体，亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构建而成的，根据它的结构特点又可分为两种转化载体，即一元载体系统和双元载体系统。,二、根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能,Ti质粒上有一段DNA，称为T-DNA(TransferredDNA)，它能转移并整合进植物基因组中，导致植物产生冠瘿瘤(crowngallTumor)并合成冠瘿碱(opine),为其生长发育和繁殖提供碳源、氮源和能量，干扰被侵染植物的正常生长。根癌农杆菌一般只侵染双子叶植物。,农杆菌属（Agrobacterium）有2种重要植物病原菌,根癌农杆菌（Agrobacteriumtumerfaciens）：携带有Ti质粒（Tumor-inducingplasmid）,发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenesis）：携带有Ri质粒(Root-inducingplasmid),在植物基因转化的研究中，主要使用细菌质粒(大肠杆菌质粒，农杆菌质粒)和植物病毒作为载体。其中以根癌农杆菌Ti质粒转化载体是最为重要，是本章重点介绍的内容。,冠瘿瘤病(根癌病)症状1、植物根及茎基部产生2、最初原因是受伤后引起,alfalfa,根癌农杆菌（Agrobacteriumtumerfaciens）,发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenesis),1、Ti质粒的遗传特性及类型,Ti质粒为染色体外遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为9.51071.6108，大小为180250kb。迄今人们已从多种植物中分离出了不同种类的农杆菌，它们的Ti质粒结构特性均有差别。根据Ti质粒诱导合成的冠瘿碱(opine)种类不同，Ti质粒可被分为四种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)、农杆菌素碱型(agrocinopine)或称琥珀碱型(succinamopine)。其中，章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒较为常见。,2、Ti质粒的基因位点及其功能区域,Ti质粒结构示意图（左）及乙酰丁香酮及其衍生物的结构示意图（右）（1）T-DNA区（transferred-DNAregions）:T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上脱离下来转移并整合到植物的核基因组上的一段DNA。T-DNA片段上的基因与肿瘤形成有关。（2）Vir区（virulenceregion）:该区段上的基因的产物为T-DNA的转移及整合所必需，它导致农杆菌产生毒性，故称之为毒区。在Vir区有VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH7个操纵子共24个基因。（3）Con区（regionsencodingconjugations）:该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra）,调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，故称为结合转移编码区。（4）Ori区（originofreplication）:该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称为复制起始区（点）。,LB,RB,三、Ti质粒介导基因转化的原理,1.植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质(如乙酰丁香酮、-羟基乙酰丁香酮等)。2.酚类物质诱导Ti质粒上毒性基因(vir)表达:当根癌农杆菌接触到植物表面的受伤部位后，这些酚类小分子化合物诱导信号经VIRA蛋白传递给VIRG，VIRG激活其它vir基因(virB、virC、virD、virE)表达Ti质粒上毒性基因(vir)表达。3.T-DNA单链分子释放：virD基因编码一种核酸内切酶，先在T-DNA右边缘区(RB)切开一个单链缺口，再在同一链左边缘区(LB)切开另一个单链缺口，使T-DNA以单链形式释放出来。4.T-DNA单链分子转移到寄主细胞：T-DNA单链分子与vir产物VIRD2蛋白共价结合，并在VIRD4和VIRB蛋白的帮助引导下穿过根癌农杆菌的内膜、外膜、细胞壁、以及植物的细胞壁、细胞膜和核膜。5.T-DNA整合到植物细胞的染色体中。T-DNA单链分子进入植物细胞后，在植物有关酶体系的催化下，互补的双链T-DNA分子。在RB序列的引导下，T-DNA分子整合到植物细胞的染色体中。6.T-DNA区域中的生长素和细胞分裂素基因过量表达导致细胞大量增值，形成冠瘿瘤，随着转化细胞的增值，T-DNA也被大量扩增，冠瘿碱合成基因的拷贝也随之增加，这些基因表达后催化合成冠瘿碱，为农杆菌的生长提供碳源和氮源。.,信号受体（VIRA）,酚类物质诱导信号,VIRG,RB,LB,转移到寄主细胞,整合到植物染色体中,T-DNA单链分子释放,VIRG激活virB、virC、virD、virE、virH表达,VIRD,植物伤口,诱导信号,信号传递,诱导表达,VIRD2、VIRD4、VIRB、VIRE2等,土壤农杆菌与植物细胞相互作用的可能性机制,酚类物质,VIRA,由此可见，农杆菌对植物的侵染作用，就是一种天然发生的基因工程。,四、Ti质粒的改造与载体构建1、天然Ti质粒的缺点Ti质粒虽然是一种有效的天然载体，但并不能直接用作克隆和转化外源基因的载体，其原因如下：T-DNA区内存在不利于植物遗传转化的基因：T-DNA区内含有许多编码基因，其中onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，使转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株再生。另外，冠瘿碱的合成会造成能量物质的浪费。Ti质粒分子量过大(一般160240kb，有的甚至达800kb)，在基因工程中难以操作。所以要切去一切不必要的大片段DNA。,大型Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点，不论用何种限制酶切割，都会切成很多片段，难以找到可利用的单一限制内切酶位点，因而不能通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因。Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。Ti质粒在大肠杆菌中不能复制，Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增，而农杆菌的接合转化率极低。因此，必须对野生型Ti质粒进行改造，去掉无用或不利的部分，加上必需的部分。下面介绍基因工程对Ti质粒的改造要求：,2、载体Ti质粒应具备的结构选择标记基因。如新霉素磷酸转移酶基因，它能使转化的植物细胞获得对卡那霉素的抗性。DNA复制起始位点。它使Ti质粒能在大肠杆菌中复制（用于克隆），而植物转化载体还同时带有可在土壤根癌农杆菌中进行复制的复制起始位点（用于转化）。T-DNA右边缘序列。它对于T-DNA的整合必不可少。目前使用的大多数克隆载体都含有两端的边缘序列。多克隆位点。为能方便克隆基因，人们在载体的左右T-DNA边缘序列之间设计了一段DNA序列，包含有一系列单个的限制性内切酶的识别位点。,3、中间载体的构建为解决Ti质粒不能直接导入目的基因的困难，需要构建中间载体(含有多种限制性酶的多个切点)。中间载体是一种在一个普通大肠杆菌的克隆载体（例如pBR322质粒）中插入了一段合适的T-DNA片段而构成的小型质粒。中间载体通常是多拷贝的E.Coli小质粒，这一点对于体外遗传操作是非常必要的。载体从功能上可分为两大类:克隆载体和表达载体。克隆载体的主要功能是复制和扩增基因，而表达载体是适于在受体细胞中表达外源基因的载体。,中间载体中插入的外源基因能否得到表达，又是一个十分重要的问题，如果不在结构基因之前加上适宜的启动子，则该基因就不能在植物中表达。因此，完整的（中间）表达载体应包括如下的结构：“植物特异性启动子+目的基因+终止子”、“植物特异性启动子+选择标记基因+终止子”和“植物特异性启动子+报告基因+终止子”，即是一种嵌合基因。,3、植物基因转化载体系统的构建,构建的中间表达载体的过程只是完成对T-DNA的改造过程，中间表达载体上缺乏Vir区，仍是一种细菌质粒，还无法使T-DNA整合到植物细胞中去，不能直接作为植物外源基因转化的载体。因此，需要构建协助中间表达载体的T-DNA整合进入植物细胞染色体中的载体系统。根据毒性基因vir与T-DNA边缘序列的作用关系，构建了2种类型的载体。一种为共整合载体系统（或二次整合载体，顺式系统cissystem）和双元载体系统（或称反式系统transsystem）。,共整合载体系统的构建,共整合载体系统（或二次整合载体，顺式系统cissystem）单链线形分子的5端为右端边缘序列(RB)，3端为左端边缘序列(LB)。共整合载体系统（co-integratedvectorsystem）是由一个中间表达载体与一个受体Ti卸甲载体之间，通过同源重组所产生的一种复合型载体。其中间表达载体属于pBR322衍生的中间载体，与受体Ti质粒同源序列是pBR322。,双元载体系统,双元载体系统（binaryvectorsystem）是一个由中间表达载体与一个含有vir区但T-DNA缺失的辅助Ti质粒（helperTi）构成的双质粒载体系统。其中间表达载体均属于广谱型，最常用的辅助Ti质粒是根癌农杆菌LBA4404所含有的Ti质粒pAL4404。,辅助Ti质粒,Ori,vir区,五、载体构建中常用的选择标记及报告基因如何选择和筛选转化体，同样是一个重要的问题。科学家们一直试图在转化体带上一个标记，从而便于选择和筛选。选择标记基因和筛选标记基因（又称报告基因）在功能和性质上有一定的差异。选择标记基因是：该基因的产物赋予植物细胞某种抵抗选择压力的能力，使转化细胞能够正常生长发育，未转化的细胞则不能甚至死亡，从而将转化细胞选择出来。筛选标记基因则强调给转化细胞带上一种标记，起报告或识别的作用，故也称为报告基因(如GUS基因、GFP基因）。,作为一种标记基因(不论是选择标记基因还是筛选标记基因)，都必须具备以下四个条件：编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；基因较小，可构成嵌合基因；能在转化细胞中充分表达；检测容易，并能定量分析。下面对一些常用的选择基因或报告基因进行介绍：,（一）选择（标记）基因1、新霉素磷酸转移酶基因（npt）npt基因又称氨基葡萄糖苷磷酸转移酶基因，最初是从细菌的转座子Tn5中分离得到，其表达产物氨基葡萄糖苷磷酸转移酶通过磷酸化使抗生素失活，从而解除抗生素的毒性。npt基因是目前植物遗传转化中应用最广泛的选择标记基因，其适用的抗生素种类为卡那霉素、庆大霉素和G418等。,未转化的草莓外植体,转化的草莓外植体,2、潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）潮霉素对许多种植物都会产生很强的毒性。细菌中存在的潮霉素磷酸转移酶基因的产物潮霉素磷酸转移酶可通过酶促磷酸化作用使潮霉素失活，从而产生对潮霉素的抗性。对某些用卡那霉素不能进行有效选择的植物（如拟南芥），通过导入该基因并使用潮霉素作选择剂，效果相当明显。,3、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）将cat基因作为选择标记基因导入植物后，转化细胞得到抗氯霉素的特性。4、其它选择标记除上述选择标记外，还有许多选择标记基因可供利用，尤其是抗除草剂基因(非抗生素素基因)，在研究中使用逐渐增多。,（二）报告基因报告基因（reportergene）通常是指在转化系统中通过其表达来确定是否转化成功的一类基因，它起到报告（而非选择）的作用，故称为报告基因。理论上讲，经过选择培养后存活的细胞及其再生植株均应是转基因的，但实际上，由于种种原因，其中仍可能大量存在着嵌合体、假转化体和自发突变产生的抗性突变体。因此，对经过选择后的细胞仍要进一步筛选，确定其为真正的转基因个体。理想的报告基因应该具备以下条件：其产物在原植物中不存在或本底很低，而且对宿主植物细胞无毒性；表达产物应有适度的稳定性以利于检测；检测方法应简单、灵敏并可以进行定量。常用的报告基因如下：,1、-葡萄糖酸酶基因（gus）gus基因是广泛应用的报告基因，它在植物细胞中产生葡萄糖苷酸酶，在一定条件下催化X-Glucuionicacid(5-溴-4-氯-3-吲哚-葡萄糖苷酸酯)底物，产生蓝色沉淀；另外，另一种底物4-MUG（4-甲基-伞形花酮-D-葡萄糖苷酸酯）在GUS作用下形成4-MU（4-甲基伞形花酮），后者在365nm光下激发产生的荧光，可用荧光光谱法检测。这种方法的检测容易，成本低廉，故被广泛使用。,常用的报告基因,-葡萄糖酸酶基因（gus）,绿色荧光蛋白基因（gfp）,冠瘿碱（opine）合成酶基因,花青素合成有关的基因,转基因烟草植株的GUS组织化学染色结果A-D，pAAP2:GUS、p35S-AAP2:GUS和p35S:GUS转基因烟草植株的根、茎、叶和花的GUS组织化学染色结果。E，在萌发的T1幼苗中也观察到了相似的GUS染色结果。WT，野生型对照烟草植株；AAP2，转化pAAP2:GUS载体的转基因烟草植株；35S-AAP2，转化p35S-AAP2:GUS载体的转基因烟草植株；35S，转化p35S:GUS载体的转基因烟草植株。,根,茎,叶,花,萌发的T1幼苗,棉花子房、胚珠及种子特异启动子调控表达的GUS组织化学染色A，FBP7启动子特异的在子房和胚珠，以及开花授粉后的种子中表达；a，开花当天的子房；b，开花两天后的子房；aa，开花当天的胚珠；c，开花后5天，发育中的种子；d，发育中的胚，没有检测到GUS基因的表达。B，AGL5启动子调控GUS基因在烟草第2期的花中表达。C，AAP1在烟草5dpa的种子中强烈的表达。D，PI启动子调控的GUS基因在花发育的第8期仅在胚珠中有微弱的表达。E，NtSC控制GUS基因在开花后的种子中表达。F，PV从种子发育开始到成熟都主要在种子的子叶中表达。G，GhSS3启动子在烟草中的表达强度较弱，主要在花和种子中表达；e，第三期的花；f，开花后两天的种子。,2、绿色荧光蛋白基因（gfp）近年来，从水母(Aequoreavictoria)克隆的绿色荧光蛋白基因正被广泛用于转基因动植物研究。其最大优点是，该基因在细胞中的表达产物在蓝光或远紫外光照射下，在有氧存在时发生绿色荧光（508nm），该反应无需使用任何基质。通过改用植物细胞偏爱的密码子，人工合成的绿色荧光蛋白基因(pgfp)的表达活性比野生型提高20倍。,3、冠瘿碱（opine）合成酶基因冠瘿碱合成酶基因（nos和ocs）存在于农杆菌T-DNA上，因其启动子是真核型，在农杆菌中不表达，故通过检测转化体中冠瘿碱的存在就可确定外源基因的表达。冠瘿碱的检测分析简单、快速和廉价，但受伤植物有时也会产生冠瘿碱，故必须设置对照。,4、花青素合成有关的基因利用与花青素合成的有关基因作为报告基因，可使转化体呈现特有颜色，那么就可以用肉眼鉴别。例如，利用玉米种子编码调控花青素生物合成的反式因子的调控基因C1、B和R，导入这些基因后可以在非种子组织诱导产生色素。,红色荧光蛋白标记导入小肠绒毛细胞中，展现出带有荧光,转红色荧光蛋白唐鱼与对照鱼,5、其它报告基因,第二节植物遗传转化方法和技术,载体转化直接转化利用种质系统转化,根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化发根农杆菌Ri质粒介导基因转化植物病毒载体介导基因转化,植物遗传转化方法,（一）根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化,当含有植物表达载体的根癌农杆菌接触到植物表面的受伤部位后，在酚类物质和vir表达产物的作用下，目的基因和选择标记基因随T-DNA一起整合到植物细胞的染色体中，使用抗生素选择出转化细胞，在含有农杆菌抑制剂的培养基上，将转化细胞再生成完整植株。,根癌农杆菌Ti质粒介导转化的基本程序,受体材料（原生质体、细胞、组织或器官等）,含植物转化载体的农杆菌菌液,诱导不定芽（常加入选择压力）,生根培养,筛选培养,外源基因整合检测(PCR、Southern检测),转基因植株,田间试验、遗传分析、性状鉴定,外源基因表达检测(RT-PCR、Northern、Western检测),共培养,侵染,CYP2C19,Nos-P,NPTII,CYP2B6,CYP1A1,无残留农药果实,Nos-T,RB,CaMV35S-P,virus5-UTR,防止农药污染,无害化,除草剂、杀虫剂等,LB,质粒载体pIKBAC,修复污染土壤,基因导入（农杆菌LBA4404介导）,能降解农药的转基因香蕉,香蕉细胞、组织,抗km幼小植株,农药降解力鉴定,外源基因整合检测,分化、选择,外源基因表达检测,转基因植株,（二）发根农杆菌Ri质粒介导基因转化,发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)与根癌农杆菌(A.tumefaciens)同属，但发根农杆菌侵染植物细胞后，会被其Ri质粒诱导产生类似于不定根的毛发状物。Ri质粒存在与根癌农杆菌Ti质粒结构相似的T-DNA区和vir区。与Ti质粒相比，Ri质粒介导转化具有下列优点：可以不经解除武装(disarm)进行转化，并且转化产生的发状根能够再生；发状根是一个单细胞克隆，可发避免产生嵌合体；可直接作中间载体；发状根适于进行离体培养，而且很多植物的发状根在离体培养条件下都表现出原植株次生代谢产物的合成能力。因此，Ri质粒不仅可作为转化的优良载体，而能应用于有价值的次生代谢物的生产。由发根农杆菌介导的遗传转化程序与根癌农杆菌介导转化无明显的区别，只是被转化细胞形成单细胞克隆的发状根，发状根再经诱导愈伤组织，再生成植株。,根癌农杆菌,发根农杆菌,（三）植物病毒载体介导基因转化,病毒DNA中存在着能被寄主细胞DNA复制和转录的酶系统所识别的核酸序列，当病毒侵染植物后，其核酸分子进入植物细胞进行自我复制和蛋白质表达。自然界中病毒侵染寄主细胞的过程与农杆菌Ti质粒相似，是一种潜在的基因转化系统。用病毒载体介导植物基因转移的方法有病毒直接接种法或农杆菌接种法等。病毒直接接种法是利用有些裸病毒基因组或包裹外壳蛋白的病毒颗粒可直接侵染植物细胞特性，将重组病毒直接接种在植物体上。农杆菌接种法是把含有外源基因的重组病毒插入农杆菌Ti质粒的T-DNA区域，通过农杆菌侵染的方式将重组病毒导入植物细胞。,二、直接转化,1、概念：是不依赖生物载体，将特殊处理的裸露DNA直接导入植物细胞，实现基因转化的技术。优点：不受农杆菌或病毒寄主范围的限制。缺点：例如外源DNA难以稳定整合进寄主细胞核基因组中，有时只能在寄主细胞中暂时表达，有可能使寄主细胞染色体发生重组而造成有害突变。由于这种方法不受植物种类限制，且有多样方法可供选择，因而有一定的应用潜力。,2、直接转化方法,1、PEG转化法2、基因枪转化法3、电击穿孔转化法4、显微注射转化法5、其它转化方法,1、PEG（聚乙二醇）转化法PEG转化是最常用的化学方法。此法的要点是将原生质体悬浮于含有DNA的介质中，用PEG(分子量子4000-6000，pH8-9）促进原生质体对DNA的摄取，从而使细胞转化。Krens等(1982)最早用Ti质粒以该方法实现了烟草的遗传转化。因该方法必须在建立起原生质体再生体系的基础上才能获得成功，从而大大限制了其应用范围。,2、基因枪转化法基因枪转化是利用高压气体作驱动力，将载有外源DNA的金属颗粒(金或钨)加速，射击的靶细胞，使DNA进入细胞内部，如果条件合适，就可使靶细胞得到转化。1987年，康乃尔大学Sanford等设计了以火药为动力的基因枪，之后又出现了高压放电型、压缩气体型、粒子流型和气枪型等。基因枪转化法最大优点是受体种类不受限制，植物、动物、微生物方面都有成功的报道。不足之处是仪器设备昂贵、转基因效率低、外源DNA的整合具有随机性等，其应用有逐渐减少的趋势。,3、电击穿孔转化法电击穿孔转化法又叫电激法，它是把悬浮在液体培养基中的植物原生质体放入带有2个电极的小室中，该培养基中除含有必要的营养成分外，还含有裸露的DNA分子，在2个电极间施加高压电脉冲，造成细胞膜出现短暂可逆性小孔，从而使外源DNA通过小孔扩散到原生质体中，待质膜小孔封闭后，外源DNA可能整合到受体基因组中。除DNA外，外源RNA、蛋白质、病毒颗粒等都可通过此方法导入受体细胞质。,4、显微注射转化法利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体细胞的细胞核或细胞质中。显微注射法的优点是转化效率高，适用于各种植物材料，无需特殊的选择系统，可以克服农杆菌宿主范围的局限性。近年这一技术也用于培养细胞或胚性细胞团等。显微注射法以精细的显微操作技术和低密度培养为基础，比较费工，所以，需要研究者有足够的耐心和毅力。5、其它的直接转化方法脂质体转化法、超声波转化法、激光微束转化法。,三、利用种质系统转化,借助植物自身的生殖系统以及细胞结构来实现转化的目的。如花粉管通道法、生殖细胞浸泡法和子房注射法等。周光宇等建立了一套通过花粉管通道导入外源基因的方法，已在棉花、水稻、小麦、大豆等作物上有成功的报道。,第三节转化体的筛选与检测,一、转化体的选择和筛选二、转基因植株的检测三、转基因植物研究中存在的问题,一、转化体的选择和筛选,在进行以上外源基因导入实验后，受体细胞中存在有转化细胞(外源基因整合到了基因组中)和非转化细胞（包括未导入外源基因的细胞和已导入但未被整合的细胞）两类，其中后者常占绝大多数。因此，在转化体的生长、发育和分化过程中，必须不断地淘汰非转化体。这个过程包括选择(selection)和筛选(screening)两个内容。选择:通过施加某种外来附加压力，实现转化体的选择。筛选：通过报告基因的特征，鉴别出真正的转化体。,二、转基因植株的检测,一）外源基因整合的检测,1、PCR法,通过对目的基因结构分析设计特异性引物，可以在微量的基因组DNA样品中扩增出目的基因片段。由于PCR具有灵敏度高、操作简便、检测通量大等优点而被广泛地应用于转基因植株的初选。但PCR反应容易出现假阳性和假阴性结果，因此必须用Southernblot等手段加以最后的验证。,PCRanalysisoftransgenicplants,MP12345678910CK,MP1234567891011CK,1)概念：Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析，它是Southern于1975年首先发明的，故称之为Southern杂交。它是将基因组DNA样品直接或经过适当的酶切电泳后转移至尼龙膜等固相支持物上，选择合适的探针标记后与之杂交，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。特点：灵敏度高，特异性强,2、Southern杂交法,2)基本原理,Southern杂交：包含三种技术，凝胶电泳、印迹技术、分子杂交。,DNA酶切电泳分离核酸片段转移至固相支持物（印迹技术）杂交洗去未杂交探针杂交信号检测,3)印迹方法虹吸印迹法、真空转移法、电转移法,虹吸印迹法（毛细转移法）,真空转移法,真空转移法,电转移法,Southern印迹杂交,转蛛丝蛋白基因的Southernblot检测,P012345678ck1ck2,3、染色体原位杂交（insituhybridization）它是确定外源基因在染色体上整合的确切位置的重要手段。其原理是利用碱基互补原则，将经同位素或荧光标记的DNA片段作为探针，与染色体标本上的基因组DNA在“原位”进行杂交，经放射自显影或荧光激发等检测手段在显微镜下直接观察分析目的基因在染色体上的整合位置。原位杂交分析结果的好坏，较大程度取决于染色体标本的质量。较好的染色体标本应该有较多的分裂相且分散良好；分裂相的核型应该完整。随着荧光显微镜技术的发展和计算机图像处理系统的应用，原位杂交的分辨率已有了很大的提高。,二）转录水平的检测,1、分子杂交法与DNA水平的分子杂交相似，将RNA直接或经电泳转移至尼龙膜等固相支持物上，选择合适的探针标记后与之杂交，从而检测出样品中是否存在由目的基因序列转录的RNA序列的分子生物学技术。在整个检测过程式中应始终保证RNA无降解，以保证目的基因的检出。,-1，4糖基转移酶在悬浮细胞中的表达,2、RNase保护分析,根据碱基互补的原理，当用设计好的RNA探针与目的基因转录的RNA分子进行杂交分析时，用RNase处理杂交分子。对探针分子而言，与靶分子完全互补的部分就会受到保护而不被降解。根据探针和靶分子的同源性不同，经电泳和放射自显影后会出现不同的带型。本方法就是根据这一原理来检测样品中目的基因转录的靶RNA分子。其灵敏度高于Northernblot分析，可区分仅有的单个碱基差别的RNA分子。在转基因研究中，对于那些同源性较高的植物种类或表达水平极低的转基因，使用RNase保护分析法更具应用价值。,3、反转录聚合酶链式反应法（RT-PCR）,RT-PCR法是检测和定量分析低丰度mRNA的快速而精确的方法。其原理是：以总RNA或mRNA为模板，用逆转录酶合成cDNA第一链，然后再以该链为模板，用事先设计的特异引物进行PCR扩增，以检测目的基因的表达。,0351015202530,A,B,C,RT-PCRanalysisoftransgenicplantA,TotalRNAisolatedfromdifferentdevelopmentalfiberstage;B,RT-PCRdetectionofGhHisgene(29cycles);C,RT-PCRdetectionofCSPgene(34cycles).*0,3,5,10,15,20,25,30:differentdayspostanthesis.,三）蛋白质水平的检测,1、Westernblot法将组织或细胞的蛋白