引物设计的要求(总结版)

引引 物物 设设 计计 1. 引物最好在模板引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。的保守区内设计。 DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同 物种的同一基因，通过序列分析软件（比如 DNAman ）比对（Alignment） ，各 基因相同的序列就是该基因的保守区。 2. 引物长度一般在引物长度一般在 1530 碱基之间。碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是 18-27 bp ，但不应大于 38，因为过长会导致 其延伸温度大于 74，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。 3. 引物 GC 含量在 40%60%之间，Tm 值最好接近 72。 GC 含量（composition ）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量 不能相差太大（约 1 度） 。有效启动温度，一般高于 Tm 值 510。Tm 值最好 接近 72以使复性条件最佳。 4. 引物引物 3 端要避开密码子的第端要避开密码子的第 3 位位。 如扩增编码区域，引物 3 端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位 易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5. 引物引物 3 端不能选择端不能选择 A，最好选择最好选择 T。 引物 3 端错配时， 不同碱基引发效率存在着很大的差异， 当末位的碱基为 A 时， 即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为 T 时，错配的引发 效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于 A、T 之间，所以 3 端最好选择 T。 6. 碱基要随机分布。碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3 端相似性较高的序列，否则 容易导致错误引发（False priming） 。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物 中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3 端不 应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样会使引物在 GC 富集序列区错误引发。 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物 本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身 不能有连续 4 个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽 量使其G 值不要过高（应小于 4.5kcal/mol ） 。否则易导致产生引物二聚体带， 并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行。 8. 引物引物 5端和中间端和中间 G 值应该相对较高值应该相对较高，而而 3端端 G 值较低值较低。 G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能， 它反映了双链结构内部碱基对的相对 稳定性，G 值越大，则双链越稳定。应当选用 5端和中间G 值相对较高，而 3端G 值较低（绝对值不超过 9）的引物。引物 3 端的G 值过高，容易 在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。 （不同位置的G 值可以用 Oligo 6 软件进行分析） 9. 引物的引物的 5 端可以修饰端可以修饰，而而 3 端不可修饰端不可修饰。 引物的 5 端决定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以 被修饰而不影响扩增的特异性。 引物 5 端修饰包括： 加酶切位点； 标记生物素、 荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入点突变、插入突变、 缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从 3端开始的，不能进行任何 修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能。 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。扩增产物的单链不能形成二级结构。 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响， 选择扩增片段时最好 避开二级结构区域。用有关软件（比如 RNAstructure）可以预测估计 mRNA 的 稳定二级结构，有助于选择模板。 11. 引物应具有特异性。引物应具有特异性。 引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性， 就可以进行下一步的实验了。 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例 如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的 的PCR ，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只 能退而求其次，尽量去满足条件。 引物设计要求简洁版 1) 避免重复碱基，尤其是 G. 2) Tm=58-60 度，一般为 72 度。 3) GC=30-80%，一般是 45%-55%。 4) 3 端最后 5 个碱基内不能有多于 2 个的 G 或 C. 5) 正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。 6) PCR 扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大， 一般在 80-250bp 之间都可； 80150 bp 最为合适（可以延长至 300 bp ） 。 7) 引物的退火温度要高，一般要在 60 度以上，一般为 72 度。 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在， 而且引物设计时应该考虑到 引物要有不受基因组 DNA 污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物 能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组污染的影响。 如果要扩全长，可直接抄写引物，如果要扩全长，可直接抄写引物，长