枯草芽孢杆菌的分离及筛选

微生物设计性实验枯草芽孢杆菌的分离及筛选1 实验目的掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。2 实验原理枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.60.91.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是 -淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。然后，进行初筛与纯化，鉴定参照伯杰氏细菌手册鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。3 实验材料3.1 选择培养基本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。配方：牛肉膏 5.0g蛋白胨 10.0g氯化钠 5.0g可溶性淀粉 10.0g琼脂 20g蒸馏水 1000ml调整 pH 至 7.2配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。3.2 溶液或试剂牛肉膏 1.25g蛋白胨 2.5g氯化钠 1.25g可溶性淀粉 2.5g琼脂 5g 碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克，100毫升 0.01NHCL。3.4 仪器或其他用品平板培养皿10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。4 实验流程倒平板制备梯度稀释液涂布培养初筛复筛纯化保存5 实验步骤实验前准备制备淀粉培养基，无菌水，在121摄氏度下灭菌20min。倒平板。把接种工具，培养基，和其他用品全部在超净工作台上摆好，进行紫外线灭菌30min。5.1 制备土壤稀释液取土样时最好选取如花坛等地方的土样，选好采样地点，铲产去表层5cm，取515cm处。用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。采样后应尽快分离。振摇约二十分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散。放入盛有99ml无菌水三角瓶中，常压80度的水浴处理样品1小时后，取出。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推，制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的土壤溶液。5.2 涂布将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-3、10-4、10-5三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-3、10-4、10-5三管土壤稀释液中各吸取 0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。用无菌涂布器涂布。右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置510min，使菌液浸入培养基。5.3 培养将淀粉培养基平板倒置于30C培养箱中培养13d。5.4 初筛观察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黄色，将这样的菌种单个菌落分别挑取少许细胞接种到培养基上，置于30C的培养箱中培养，若发现有杂菌，需要再一次进行分离纯化。（如不能用肉眼更好的观察，可对其进行革兰氏染色，在显微镜下观察，与标准菌种比较。）5.8 复筛测定其淀粉酶活。5.8.1 试剂和器材1、试剂：（1）碘原液：称取碘11克，碘化钾22克，加水溶解，稀释至500毫升。（2）稀碘液：取碘原液2毫升，加碘化钾20克，稀释至500毫升，此试剂随配随用。（3）2%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉2克，加5毫升蒸馏水，搅拌混和，再徐徐倾入70毫升煮沸的蒸馏水中。继续煮沸2分钟，冷却至室温，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH为6）（4）柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）45.23克，柠檬酸 （C6H8O7H2O）8.068克，加水溶解，稀释至1000毫升。（5）标准比色液：称取氯化钴（CoCL26H2O）25克和重铬酸钾3.34克溶于100毫升0.01N HCL，其五倍稀释作标准。（6）样品：细菌-淀粉酶 2、器材（1）电热恒温水浴 （2）试管（3）量筒 （4）吸量管（1ml）5.8.2 操作方法：1、取试管1支，加20毫升2%淀粉，混匀，在30水浴中，使管内温度达到30。2、将淀粉酶0.5ml加到30的淀粉液中，混匀，在30水浴中保温，自加入记时，经5分钟后取反应液1毫升，加入盛有5毫升稀碘液的试管中。混匀，目测比色，每隔一定时间重复测定，直至呈色与标准比色颜色相同为止，记录反应进行的时间。3、计算。在上述条件下，每一小时催化1毫升2%可溶性淀粉水解的酶量，定为一个酶活力单位。5.9 纯化并保存菌种保存时一般都需要不受杂菌污染，菌种变异很少，并能尽量保持细菌的形态和生理性状不发生变化。同时，做好以下工作：（1）做好菌种保存记录，注明菌种名称，分离年月日、分离者姓名、分离地点等。（2）防止杂菌污染及意外事故，把菌种保存在23只试管中备用。（3）原始菌种妥善保存。6 结果与分析6.1 分离到枯草芽孢杆菌菌的株数6.2 枯草芽孢杆菌产酶活性大小及形态观察鉴定结果【注明参考文献，格式参考学术论文样式】枯草芽孢杆菌的鉴定实验1、形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等）（1）单个菌体的形态（2）群体形态的观察2、革兰氏染色3、芽孢染色4、菌体大小测量5、枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定：一、过氧化氢酶测定1、原理：过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水和氧2、试剂：310%过氧化氢培养基：肉汤琼脂培养基3、操作步骤：将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，30 培养 12 天。取一干净载玻片，在上面加一滴 310%的过氧化氢，挑取一环培养 12 天的菌苔，在过氧化氢 溶液中涂抹， 若有气泡（氧气）出现，记作过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。也可将液直接加入斜面上，观察气泡的产生。 二、需氧性试验1、原理：不同种类的芽孢杆菌对氧气的需求性常有差异，因此本实验可作为鉴定芽孢杆菌 的一个较重要指标。 2、培养基：半固体培养基 3、操作步骤：用一小环的肉汤菌液穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底），一般于 30 培养 3 7 天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺 线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌 三、乙酰甲基甲醇实验 1、 原理： 本实验是测定芽孢杆菌 （或其他细菌） 发酵葡萄糖的变化。 有些芽孢杆菌发酵葡萄糖 产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇或 的胍基起作用，生成红色化合物，即表示 2,3-丁二醇。乙酰 甲基甲醇在碱性环境中可被空气中的氧气氧化成二乙酰， 后者与蛋白胨中精氨酸所含 V.P. 试验阳性。若在培养基中加入少量肌酸以补充胍基，可加速反应。反应式如下： 2 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 + 2 二氧化碳； -2H 乙酰甲基甲醇 二乙酰； +KOH 缩合 二乙酰 + NH=C(NH 2)2 红色化合物 2、 培养基和试剂 培养基：蛋白胨 5g，葡萄糖 5g， NaCl 5g ，蒸馏水 1000ml。调节 PH 6.5，每管分装 4 5ml ，0.06MPa（ 8lbf/in2 ） 30min 灭菌 试剂： 3、 步骤： 1.接种与培养 将芽孢杆菌测试菌接种于上述培养液中，一般于 30 摄氏度培养 4 天。 2.结果观察 在培养 4 天后，取培养液（约 2ml）和等量的 40%NAOH 相混合，如少量肌酸 （约 0.5 1mg） ，充分振荡， 2 5min 后如培养液呈红色，即为 V.P. 试验阳性， 有时须放置更长时间才出现红色反应。 四、淀粉水解 1、原理： 许多芽孢杆菌产生淀粉酶， 能将培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子物质或进 一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 2、 培养基及试剂： 培 养 基 ： 在 肉 汤 琼 脂 中 添 加 0.2% 的 可 溶 性 淀 粉 ， 分 装 于 三 角 瓶 。 0.1MPa(15lbf/in2)20min 灭菌备用。 试剂： 3、步骤： 将培养基融化后，冷却至 50 摄氏度左右，倒成平板，凝固后取菌种点钟于平板上 （每皿点钟 2 点） ，一般于 30 摄氏度培养 2 4 天，形成菌落后， 在平板上滴加卢哥 尔氏碘液，以铺满菌落为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有五色透明圈出现，说明 淀粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。 卢哥尔氏碘液 40%NAOH